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¿Qué es la proteína de fusión GST RhoA?

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¿Podría explicarme qué significa la proteína de fusión GST RhoA y en qué se diferencia de la proteína RhoA? Estoy haciendo una especie de experimento con esta proteína.


GST es glutatión-S-transferasa, una enzima que se une de manera razonablemente estrecha al glutatión. A menudo se utiliza como etiqueta para purificar proteínas de interés. En su caso, lo más probable es que GST se haya fusionado con RhoA para que tenga algunos medios para purificarlo aplicándolo a una columna conjugada con glutatión. Consulte aquí para obtener más información.


Preparación de proteínas de fusión GST

Este protocolo describe la preparación de glutatión-Sproteínas de fusión -transferasa (GST), que han tenido una amplia gama de aplicaciones desde su introducción como herramientas para la síntesis de proteínas recombinantes en bacterias. La GST se seleccionó originalmente como un resto de fusión debido a varias propiedades deseables. En primer lugar, cuando se expresa en bacterias solas o como una fusión, la GST no se secuestra en los cuerpos de inclusión (a diferencia de los sistemas de proteínas de fusión anteriores). En segundo lugar, la GST se puede purificar por afinidad sin desnaturalización porque se une al glutatión inmovilizado, que proporciona la base para una purificación simple. En consecuencia, las proteínas de fusión GST se utilizan de forma rutinaria para la generación y purificación de anticuerpos, estudios de interacción proteína-proteína y análisis bioquímico.


Abstracto

En las células somáticas, la RHOA media la dinámica de la actina a través de una cascada de señalización mediada por GNA13 que implica la quinasa RHO (ROCK), la quinasa LIM (LIMK) y la cofilina. La proteína quinasa A (PRKA) puede regular negativamente la RHOA e interactúa con miembros de la familia de anclaje de quinasa A (AKAP) a través de proteínas intermediarias. En los espermatozoides, la polimerización de actina precede a la reacción del acrosoma, que es necesaria para la fertilidad normal. El presente estudio se llevó a cabo para determinar si la vía de señalización RHOA mediada por GNA13 puede estar involucrada en la reacción acrosómica en el esperma caudal bovino, y si las AKAP pueden estar involucradas en su orientación y regulación. Se detectaron GNA13, RHOA, ROCK2, LIMK2 y cofilina mediante transferencia Western en esperma caudal bovino. La superposición, la inmunoprecipitación y el posterior análisis de espectrometría de masas identificaron varias proteínas que interactúan con RHOA, incluida la proacrosina, la enzima convertidora de angiotensina, la tubulina, la aldolasa C y AKAP4. Usando técnicas de superposición y pulldown, demostramos que la fosforilación de AKAP3 aumenta su interacción con las proteínas que interactúan con RHOA PRKAR2 (la subunidad reguladora de tipo II de PRKA, anteriormente RII) y ropporin (ROPN1, una proteína similar a PRKAR2, o R2D2). La variación de las concentraciones de calcio en los ensayos de reducción no alteró significativamente la unión a las proteínas R2D2. Estos datos sugieren que la vía de RHOA-ROCK-LIMK-cofilina mediada por GNA13 reguladora de actina está presente en espermatozoides bovinos, que RHOA interactúa con proteínas involucradas en la capacitación y la reacción acrosómica, y que la señalización de RHOA en los espermatozoides puede ser dirigida por AKAP. Finalmente, la unión de AKAP3 a PRKAR2 y ROPN1 está regulada por fosforilación in vitro.


Expresando proteína GST-Fusion - ¿Son más difíciles de expresar las inserciones de proteínas más grandes? (19 / Sep / 2005)

Estoy tratando de expresar mi proteína de fusión GST y sus mutantes. Noté que los mutantes de tamaño de proteína más cortos y la GST sola se expresaban mejor (es decir, en comassie, las bandas son más grandes y se tiñen más intensamente). ¿Podría ser que cuanto más grande sea el inserto de proteína, más difícil será para el BL21 DE3 transcribir / traducir la proteína de fusión GST? Si es así, ¿qué puedo hacer para superar la inconsistencia? ¿Debería inducir la proteína de fusión más grande durante más tiempo?

Gracias por tomarse el tiempo de leer esto. Espero escuchar algo pronto.

Lo más probable es que no sea un problema de traducción, sino de estabilidad. En mi laboratorio, la mayoría de las construcciones de fusión que contienen GST en realidad mostrarán dos bandas de sobreexpresión distintas en el gel: fusión GST + y GST sola. Supongo que la célula degrada la parte extra, aunque también es posible que se desprenda del ribosoma antes de tiempo.

Hemos tenido suerte al minimizar la presencia de la etiqueta GST sola reduciendo la temperatura de inducción y aumentando el tiempo de crecimiento (16 C durante la noche). Esto podría ayudar en su caso.

Las temperaturas más bajas mejorarán la solubilidad y la expresión en algunas construcciones.

También puede intentar aplicar un choque térmico a las células durante 30 minutos a 42ºC antes de iniciar la inducción, seguido de un crecimiento a 18-24ºC.

Gracias por tus consejos. Probé tus métodos pero todavía no puedo conseguir una expresión decente. Mi sospecha es que mi proteína GST-fusioína está en el sedimento, es decir, insoluble. El tamaño de la proteína es

100kDa. Si ese es el caso, ¿tiene algún protocolo para recuperar la proteína insoluble del sedimento?

Muchas gracias por toda su ayuda & # 33 & # 33

Para comprobar la insolubilidad, puede hacer un experimento sencillo. Haga crecer sus células (5 ml es suficiente), sedimente y realice una lisis de perlas de vidrio. Girar el lisado y eliminar la fracción soluble. Hierva su pellet en tampón desnaturalizante. Ejecute un poco de lo soluble e insoluble en un gel y tinte. Probablemente verá su proteína en la fracción soluble o insoluble.


La toxina B de Clostridium difficile actúa sobre la proteína de unión a GTP Rho

La toxina B de Clostridium difficile exhibe actividad citotóxica que se caracteriza por la alteración del citoesqueleto microfilamental. Aquí estudiamos si la proteína Rho que se une a GTP, que según se informa participa en la regulación del citoesqueleto de actina, está involucrada en la acción de la toxina. El tratamiento con toxina B de las células de ovario de hámster chino revela una disminución dependiente del tiempo y de la concentración en la ADP-ribosilación de Rho por la exoenzima C3 de Clostridium botulinum en el lisado celular. La alteración del sistema de microfilamentos inducida por la toxina C2 de C. botulinum o la citocalasina D no causa una alteración de la ADP-ribosilación de Rho. La toxina B exhibe sus efectos sobre Rho no solo en células intactas sino también cuando se agrega a lisados ​​celulares. Además de la Rho endógena, la proteína de fusión RhoA-glutatión S-transferasa (Rho-GST) añadida al lisado celular mostró una disminución de la ribosilación de ADP después del tratamiento con la toxina B. El análisis de inmunotransferencia revela cantidades idénticas de Rho-GST y ningún cambio en la masa molecular después del tratamiento con toxina B en comparación con los controles. Se inhibe la ribosilación con ADP de Rho-GST purificada a partir del lisado de células tratadas con toxina B, lo que indica una modificación de la propia Rho. Finalmente, la transfección de ADN rhoA bajo el control de un promotor fuerte en las células las protege de la actividad de la toxina B. En conjunto, los datos indican que la toxina B de C. difficile actúa directa o indirectamente sobre las proteínas Rho para inhibir la ribosilación de ADP y sugieren que el efecto citotóxico de la toxina B involucra a Rho.


Purificación de proteínas de fusión de GST a partir de bacterias: varias preguntas sobre la purificación de proteínas (22 / Jul / 2007)

Planeo purificar la proteína de fusión GST de bacterias (BL21) y tengo algunas preguntas al respecto.

1. Después de la inducción de IPTG y antes de lisar las bacterias, ¿puedo congelar el sedimento de células bacterianas a -80 ° C y lisarlas más tarde?

2. Para lisar las bacterias por sonicación, el protocolo dice 15 s X 3 veces.
A. ¿A qué fuerza (nuestro sonicador de laboratorio tiene un selector 0-10) sonico?
B. ¿Cuánto tiempo tengo que esperar para enfriar la solución?

Planeo purificar la proteína de fusión GST de bacterias (BL21) y tengo algunas preguntas al respecto.

1. Después de la inducción de IPTG y antes de lisar las bacterias, ¿puedo congelar el sedimento de células bacterianas a -80C y lisarlas más tarde?

2. Para lisar las bacterias por sonicación, el protocolo dice 15 s X 3 veces.
A. ¿A qué fuerza (nuestro sonicador de laboratorio tiene un selector 0-10) sonico?
B. ¿Cuánto tiempo tengo que esperar para enfriar la solución?

Hola,
1. Está bien, aunque, por supuesto, el fresco siempre tiene menos posibilidades de degradación de las proteínas.
2. En realidad, esto depende mucho de la experiencia y las preferencias personales. No sé si su máquina es como la nuestra, pero la nuestra tiene dos códigos de color en el selector, negro y rojo. los negros son de menor fuerza y ​​los rojos son más altos, por lo que son más peligrosos (para sus oídos). Normalmente usamos 4, justo en el borde entre rojo y negro. Hice 3-4 veces 15-20 segundos con 15-20 segundos de descanso en el medio. Los puntos principales son: hágalo en una habitación fría, lo mejor es mantener sus muestras en hielo, no permita que las muestras se calienten, no coloque la punta del sonicador demasiado profundamente dentro de las bacterias suspendidas, manténgala justo debajo de la superficie. Puede comprobar la muestra de vez en cuando, cuando se vea homogénea (como líquida, más clara que con bacterias suspendidas, puede ver la diferencia sosteniéndola bajo la luz y mirar a través de ella), entonces está lista. No puedo describir mejor que esto, lo siento.

Planeo purificar la proteína de fusión GST de bacterias (BL21) y tengo algunas preguntas al respecto.

1. Después de la inducción de IPTG y antes de lisar las bacterias, ¿puedo congelar el sedimento de células bacterianas a -80C y lisarlas más tarde?

2. Para lisar las bacterias por sonicación, el protocolo dice 15 s X 3 veces.
A. ¿Con qué fuerza (nuestro sonicador de laboratorio tiene un selector 0-10) sonico?
B. ¿Cuánto tiempo tengo que esperar para enfriar la solución?

Hola,
1. Está bien, aunque, por supuesto, el fresco siempre tiene menos posibilidades de degradación de las proteínas.
2. En realidad, esto depende mucho de la experiencia y las preferencias personales. No sé si su máquina es como la nuestra, pero la nuestra tiene dos códigos de color en el selector, negro y rojo. los negros son de menor fuerza y ​​los rojos son más altos, por lo que son más peligrosos (para sus oídos). Normalmente usamos 4, justo en el borde entre rojo y negro. Hice 3-4 veces 15-20 segundos con 15-20 segundos de descanso en el medio. Los puntos principales son: hágalo en una habitación fría, lo mejor es mantener sus muestras en hielo, no permita que las muestras se calienten, no coloque la punta del sonicador demasiado profundamente dentro de las bacterias suspendidas, manténgala justo debajo de la superficie. Puede comprobar la muestra de vez en cuando, cuando se vea homogénea (como líquida, más clara que con bacterias suspendidas, puede ver la diferencia sosteniéndola bajo la luz y mirar a través de ella), entonces está lista. No puedo describir mejor que esto, lo siento.

1. Después de la inducción de IPTG y antes de lisar las bacterias, ¿puedo congelar el sedimento de células bacterianas a -80C y lisarlas más tarde ?: Congelar y descongelar también las células bacterianas lisadas & # 33

2. Para lisar las bacterias por sonicación, el protocolo dice 15 s X 3 veces. , también puede hacer 10s x 4. Como señaló Almasy, mantenga las muestras en hielo. No permita que la sonda toque la pared del tubo.

A. ¿A qué fuerza (nuestro sonicador de laboratorio tiene un selector de 0-10) debo someter a ultrasonidos? Debe elegir la sonda correcta, que depende del tamaño de su tubo. A menudo elijo a las 3 o 4, no demasiado ruidoso.

B. ¿Cuánto tiempo tengo que esperar para enfriar la solución? --- solo 1 minuto, o debe hacer varios tubos y turnarse para cada tubo

Tengo 3 proteínas de fusión GST y no puedo obtener una buena expresión después de la inducción de IPTG. El GST por sí solo se expresa muy bien. Me preguntaba si alguien sabe cómo mejorar la expresión de proteínas de fusión GST de E-coli. ¿Ayudará agregar glucosa? ¿O debería cambiar el huésped bacteriano?


Receptores acoplados a proteína G

Chunmin Dong, Guangyu Wu, en Métodos en enzimología, 2013

2.2 Ensayo de reducción de la proteína de fusión GST

Se homogeneizan células HEK293 (con o sin transfección ARF1) o tejidos cerebrales en tampón de lisis que contiene 50 mMETRO Tris – HCl, pH 8,0, 150 mMETRO NaCl, 5 mMETRO Se preparan EDTA, NP-40 al 1% y lisados ​​totales como se describió anteriormente (Wu, Bernard, & amp Lanier, 2002).

Proteínas de fusión GST y GST que codifican los dominios intracelulares de α2B-AR se expresan en bacterias y se purifican usando perlas de glutatión Sepharose 4B como se describió anteriormente (Wu et al., 2002). La pureza de las proteínas de fusión GST purificadas se analiza mediante tinción con azul brillante de Coomassie después de SDS-PAGE antes de los experimentos. Las proteínas de fusión GST unidas a las perlas de glutatión se utilizan inmediatamente o se almacenan a 4 ° C durante no más de 3 días.

Las proteínas de fusión GST (aproximadamente 5 μg) inmovilizadas en la resina de glutatión se incuban con 1 mg de lisados ​​de células o tejidos en un volumen total de 500 μl de tampón de unión que contiene 20 mlMETRO Tris – HCl, pH 7.5, 2% NP-40 y 70 mMETRO NaCl. Deben optimizarse las concentraciones de NaCl y NP-40 en el tampón de unión. Hemos utilizado NaCl de 70 a 150 mMETRO y NP-40 del 0,5% al ​​4% en el ensayo. La incubación se puede realizar a 4 ° C durante la noche oa temperatura ambiente durante 3 h.

La resina se lava cuatro veces con 1 ml de tampón de unión. El ARF1 unido se eluye con tampón de carga de gel SDS 1x, se separa por SDS-PAGE y se detecta mediante inmunotransferencia usando anticuerpos ARF1.

Para determinar si la interacción entre los GPCR y las GTPasas pequeñas es directa, las GTPasas pequeñas se purifican y luego se incuban con proteínas de fusión GST que codifican dominios receptores. Hemos utilizado el siguiente protocolo para mostrar la interacción directa entre el extremo C-terminal y el tercer bucle intracelular de α2B-AR y ARF1 (Fig. 6.2 A). ARF1 se marcó con el epítopo His en su extremo N-terminal, y His-ARF1 se purificó utilizando el kit His SpinTrap de GE Healthcare. Se incubó un microgramo de His-ARF1 purificado con proteínas de fusión GST a 4ºC durante 2 h. La resina se lavó cuatro veces con 1 ml de tampón de unión y las proteínas retenidas se solubilizaron en tampón de carga de gel SDS 1x y se separaron mediante SDS-PAGE. El His-ARF1 unido se detectó mediante inmunotransferencia utilizando anticuerpos His o ARF1 (Dong, Zhang, et al., 2010).

Figura 6.2. Interacción de α2B-AR y β2-AR con Rab8 y ARF1 según lo determinado por el ensayo de reducción de la proteína de fusión GST. (A) Interacción del tercer bucle intracelular (ICL3) y el extremo C-terminal (CT) de α2B-AR con ARF1 purificado. ARF1 se marcó con 6 x His y se purificó. El ICL3 y el CT de α2B-AR se generaron como proteínas de fusión GST y se incubaron con ARF1 etiquetado con His purificado. El His-ARF1 unido se detectó mediante inmunotransferencia utilizando anticuerpos ARF1 (Dong, Zhang, et al., 2010). (B) Interacción de la β2-AR CT con Rab8 y el papel del motivo LL. El β2-AR CT y su mutante en el que LL se mutó a AA se generaron como proteínas de fusión GST. Rab8 etiquetado con GFP se expresó en células HEK293, y los homogeneizados de células totales se incubaron con GST-β2-Proteínas de fusión AR CT. Rab8 unido a β2-AR CT se reveló mediante inmunotransferencia utilizando anticuerpos GFP (Dong, Yang, et al., 2010). (C) El motivo diW en ICL3 media α2B-Interacción AR con ARF1. Cada residuo en el fragmento de ICL3 W359-E369 se mutó a alanina y se generó como proteínas de fusión GST. Su interacción con ARF1 se determinó mediante un ensayo de reducción de la proteína de fusión GST (Dong et al., 2011).

Este método también se puede utilizar para determinar si la interacción entre los GPCR y las pequeñas GTPasas depende de la activación de las pequeñas GTPasas. Con este fin, se expresan en las células mutantes de la GTPasa unidos a GDP inactivo o GTP activo, y los lisados ​​celulares se incuban con proteínas de fusión GST que codifican los dominios del receptor. Se comparan las cantidades de la pequeña GTPasa mutada unida a los dominios del receptor (Dong, Yang, et al., 2010).


Purificación de proteínas con etiqueta GST

Cómo purificar las proteínas de fusión GST

Para generar construcciones que expresan proteínas de fusión GST, las secuencias que codifican la proteína de interés pueden insertarse en vectores disponibles comercialmente. Además de su uso para la purificación por afinidad, la etiqueta GST se utiliza con frecuencia en los denominados experimentos pull-down para investigar las interacciones proteína-proteína.

La escala de purificación de proteínas marcadas con GST depende de la cantidad de proteína en la preparación. Se debe elegir un tamaño de columna y una capacidad de unión total que coincida aproximadamente con la cantidad de proteína a purificar. Normalmente se retienen muy pocas proteínas no marcadas en la resina si la proteína diana ocupa casi todos los sitios de unión al glutatión disponibles (sitios de fusión GST). Si se usa demasiada matriz, otras proteínas pueden unirse de manera inespecífica a sitios desocupados.

En la purificación de la proteína de fusión GST, las proteínas etiquetadas con GST contenidas en un lisado aclarado se unen al glutatión inmovilizado (GSH, Bind). Y las proteínas que no se unen se lavan de la matriz (Wash) y las proteínas de fusión GST unidas se eluyen del soporte mediante la adición de glutatión reducido en exceso (Elute).

Purificación de proteínas de fusión GST con cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad es uno de los tipos de cromatografía más selectivos y puede ser una técnica muy útil para la purificación de proteínas. Un método conveniente de expresión de proteínas y posterior purificación es fusionar una proteína con un dominio de glutatión-S-transferasa (GST). La estrategia de purificación general es, por tanto, unir la proteína de fusión GST en una columna de glutatión inmovilizado, lavar todas las demás sustancias y luego eluir la proteína.

Hay cuatro pasos principales para purificar una proteína de fusión GST:
1. Soluciones para preparar Tampón A para columna de glutatión
2. Purificación de la columna de glutatión
3. Evaluación de la purificación
4. Eliminación de glutatión en una columna Nap-10

Además de la purificación por afinidad, otras aplicaciones de las proteínas de fusión etiquetadas con GST son posibles con la ayuda de las químicas del ligando de glutatión o los anticuerpos específicos de la etiqueta de GST, como Recubrimiento de microplacas, desplegable de interacción de proteínas y ELISA o Western blot.


Resultados

Identificación de hCdGAP (CdGAP humano)

Hemos identificado y caracterizado previamente dos isoformas de CdGAP en tejidos de ratón, mCdGAP-s y mCdGAP-1 (Tcherkezian et al., 2005). Además, los genes relacionados con CdGAP están presentes en diferentes organismos, como humanos, ratas, moscas, ranas, pollos, gusanos y peces (Tcherkezian et al., 2005). En Drosophila melanogaster, está presente un solo gen que codifica una proteína putativa con un alto grado de homología con mCdGAP (Sagnier et al., 2000). También se encuentran en humanos al menos tres genes diferentes que codifican proteínas que son altamente homólogas con mCdGAP-1. Una proteína llamada Grit (también conocida como p200RhoGAP, GC-GAP, RICS y p250GAP), que comparte un 68% de homología con mCdGAP-1 dentro del dominio rhoGAP, ha sido caracterizada previamente (Nakamura et al., 2002 Moon et al., 2003 Okabe et al., 2003 Taniguchi et al., 2003 Zhao et al., 2003). Un ADNc no caracterizado, F25965_3, que codifica una proteína putativa relacionada con TCGAP de ratón (TC10 / Cdc42 GAP) (Chiang et al., 2003) también existe en humanos y comparte 64% de homología con mCdGAP-1 dentro del dominio rhoGAP. El ADNc KIAA1204 (número de acceso de GenBank BAA86518) codifica una proteína putativa de 1444 aminoácidos que comparte una identidad de secuencia del 97% con mCdGAP-1 dentro del dominio rhoGAP y una identidad del 76% dentro de la secuencia de aminoácidos completa. Hemos llamado a esta nueva proteína RhoGAP hCdGAP, basándonos en su alta homología de secuencia de aminoácidos con mCdGAP (Figura 1A). Similar a mCdGAP-1, hCdGAP contiene un dominio RhoGAP N-terminal seguido de una secuencia de aminoácidos larga enriquecida tanto en serina como en residuos cargados. hCdGAP también contiene dos secuencias ricas en prolina con sitios de unión a SH3 consenso, uno de los cuales se conserva entre hCdGAP y mCdGAP (Figura 1B).

Comparación de las secuencias de aminoácidos de hCdGAP y mCdGAP

(A) Secuencias de aminoácidos de hCdGAP (KIAA1204) y mCdGAP. El ortólogo humano comparte un 76% de identidad en toda su secuencia de proteínas con mCdGAP. El dominio RhoGAP está subrayado y las secuencias ricas en prolina están en negrita •, aminoácidos idénticos. (B) Secuencia de alineación de las regiones ricas en prolina de hCdGAP y mCdGAP con la secuencia consenso del motivo de unión a SH3. La arginina crítica (en consenso de clase II) y las prolina están en negrita p, residuo X preferido de prolina, residuo no conservado *, motivo de unión a SH3 conservado en las secuencias de hCdGAP y mCdGAP.

Para examinar el patrón de expresión del ARNm de hCdGAP, usamos una transferencia Northern de tejido fetal humano comercial que contiene solo ARN poliadenilado. Para garantizar la especificidad de la señal, se diseñó una sonda radiomarcada fuera del dominio RhoGAP N-terminal conservado. El análisis de transferencia Northern reveló la presencia de dos transcripciones de hCdGAP a aprox. 7,5 kb y 1,35 kb. La banda de 7,5 kb está presente en todos los tejidos, pero está significativamente enriquecida en los tejidos cardíacos y musculares (Figura 2A). El cerebro, el hígado y el riñón mostraron poca señal detectable, sin embargo, a una exposición más prolongada se observaron niveles bajos de ARNm (datos no mostrados). Sólo el corazón y el músculo mostraron niveles detectables de la transcripción de 1,35 kb. Concluimos que de forma similar a mCdGAP (Lamarche-Vane y Hall, 1998), el mRNA de hCdGAP se expresa en la mayoría de los tejidos, aunque a diferentes niveles de expresión. Usando anticuerpos policlonales contra la quinta secuencia rica en prolina de CdGAP, se detectan tres bandas principales de 250 kDa, 155 kDa y 90 kDa en lisados ​​de proteínas de diferentes tejidos fetales humanos (Figura 2B). Estas bandas no fueron reconocidas en transferencias Western usando sueros preinmunes (datos no mostrados). Similar a las proteínas mCdGAP, hCdGAP también migra más lentamente que su masa molecular esperada de 155 kDa cuando se sobreexpresa en líneas celulares (Figura 2B, carril 1) (Tcherkezian et al., 2005). Esta isoforma de 250 kDa se expresa en gran medida en el corazón y el músculo, donde el ARNm también es muy abundante. Las isoformas de 155 kDa y 90 kDa se expresan principalmente en el cerebro y el riñón, respectivamente. En contraste con mCdGAP, hCdGAP no se expresa en el hígado y se encuentra una expresión muy baja de hCdGAP en los tejidos pulmonares. Llegamos a la conclusión de que la expresión de la proteína y el ARNm de hCdGAP es similar, y que las proteínas mCdGAP y hCdGAP muestran diferentes patrones de expresión tisular.

Distribución tisular de ARNm y proteínas de hCdGAP

(A) El ARNm de poli (A) + de tejidos fetales humanos (ClonTech) se sometió a análisis de transferencia Northern utilizando un fragmento SmaI / EcoRI marcado radiactivamente (1216-1517 pb) de ADNc de hCdGAP como sonda. Las flechas indican los dos ARNm de hCdGAP predominantes. (B) Los lisados ​​de células de proteína total de tejidos fetales humanos (carriles 2-12) o células COS-7 que sobreexpresan hCdGAP (carril 1) se resolvieron mediante SDS / PAGE, y CdGAP se reveló mediante análisis de inmunotransferencia con anticuerpo policlonal anti-CdGAP. Carril 1, 40 μg carriles 2 a 12, 50 μg. Las flechas indican los tres principales CdGAP.

Actividades de hCdGAP in vitro y en vivo

Para determinar si hCdGAP codifica una actividad GAP funcional hacia Rho GTPasas, se subclonaron los aminoácidos 1-505 de hCdGAP en el pGEX-4T3 Escherichia coli vector de expresión como se describe en la sección Materiales y métodos. La Figura 3 muestra que, de forma similar a mCdGAP, el dominio GAP de hCdGAP estimula la actividad GTPasa intrínseca tanto de Cdc42 como de Rac1, pero no de RhoA. Estos resultados indican que el dominio RhoGAP tanto de mCdGAP como de hCdGAP se comporta de manera similar in vitro. Evaluar la especificidad de hCdGAP hacia las Rho GTPasas en vivo, se microinyectó un vector de expresión eucariota pRK5 que codifica la hCdGAP de longitud completa etiquetada con Myc en fibroblastos Swiss-3T3 subconfluentes privados de suero, y se examinaron sus efectos sobre los cambios de actina inducidos por la adición de factores extracelulares mediante tinción de filamentos de actina con TRITC (tetrametilrodamina faloidina conjugada con β-isotiocianato). La Figura 4 muestra que la expresión de hCdGAP inhibió la ondulación de la membrana inducida por PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) dependiente de Rac y filopodios inducidos por bradicinina dependiente de Cdc42. Sin embargo, no afectó a la formación de fibras de estrés inducidas por LPA (ácido lisofosfatídico) dependiente de Rho. De manera similar a mCdGAP, estos resultados muestran que hCdGAP puede regular a la baja tanto Cdc42 como Rac1 en vivo.

Análisis de la actividad de hCdGAP recombinante in vitro

Se produjeron RhoA, Rac1, Cdc42, mCdGAP y hCdGAP usando el vector de expresión pGEX como se describió previamente (Lamarche-Vane y Hall, 1998). Se agregaron concentraciones iguales (0,2 μM) de GST recombinante — hCdGAP (aminoácidos 1–505) o GST — mCdGAP (aminoácidos 3–662) a un ensayo de GAP utilizando Cdc42 cargado con [γ- 32 P] GTP 1,3 μM (A), Rac1 (B) o RhoA (C). ♦, actividades intrínsecas de GTPasa ▪, actividad de mCdGAP ▴, actividad de hCdGAP.

hCdGAP inhibe la remodelación de actina inducida por PDGF y bradicinina, pero no LPA

Las células Swiss 3T3 subconfluentes privadas de suero se fijaron después de no estimulación (A y mi), después del tratamiento con 100 ng / ml de bradicinina durante 5 min (B y F), 3 ng / ml de PDGF durante 12 min (C y GRAMO) y 200 ng / ml de LPA durante 30 min (D y H). (miH) Las células se microinyectaron con hCdGAP que codifica pRK5Myc (0,1 mg / ml) 2 h antes de la estimulación. La actina filamentosa se visualizó mediante faloidina conjugada con TRITC, y las células inyectadas se localizaron mediante tinción conjunta con un anticuerpo anti-Myc y mediante inmunofluorescencia indirecta. Aprox. Se microinyectaron 100 células por cubreobjetos.

HCdGAP se fosforila en residuos de serina y treonina en vivo

Anteriormente encontramos que mCdGAP-sy mCdGAP-1 están altamente fosforilados en residuos de serina y treonina en células de fibroblastos (Tcherkezian et al., 2005). Dado que la secuencia de aminoácidos de hCdGAP también contiene muchos sitios de fosforilación putativos para diferentes proteína quinasas, como ERK, RSK (p90 ribosomal S6 quinasa), CK2 (proteína quinasa CK2) y PKC (proteína quinasa C), planteamos la hipótesis de que hCdGAP también puede estar fosforilado. Examinar si la hCdGAP está fosforilada en vivo, HCdGAP y mCdGAP-1 etiquetados con Myc se expresaron en fibroblastos COS-7, y las células se incubaron en medio sin fosfato complementado con [32 P] PI durante 2 h antes de la lisis. Como se muestra en la Figura 5 (A), ambas proteínas CdGAP inmunoprecipitadas están fosforiladas en vivo en un grado similar en las células COS-7. Para evaluar el contenido de residuos fosforilados en hCdGAP, se realizó un análisis de fosfoaminoácidos de hCdGAP inmunoprecipitado y reveló que, de forma similar a mCdGAP, la proteína humana también se fosforila en residuos de serina y, en menor medida, en treonina, y no en tirosina. residuos (Figura 5B). La ausencia de fosforilación de tirosina también se confirmó mediante inmunotransferencia usando anticuerpos anti-fosfotirosina (datos no mostrados). Por tanto, estos resultados demuestran que hCdGAP también se fosforila en residuos de serina y treonina en células de fibroblastos. Hemos informado anteriormente que mCdGAP interactúa con las proteínas ERK1 / 2 principalmente a través de un sitio de acoplamiento ERK conocido como el dominio DEF (sitio de acoplamiento para ERK Phe-Xaa-Phe-Pro), y que ERK fosforila mCdGAP en Thr 776 que se encuentra en un sitio de fosforilación de consenso ERK (Pro-Pro-Thr-Pro) (Tcherkezian et al., 2005). Este motivo de fosforilación consenso ERK también se conserva en hCdGAP, pero a diferencia de mCdGAP, el dominio DEF está ausente. Por lo tanto, investigamos si ERK1 / 2 todavía pueden co-inmunoprecipitar con hCdGAP. Como se muestra en la Figura 5 (C), ERK1 / 2 co-inmunoprecipitado con hCdGAP y mCdGAP, lo que sugiere que hCdGAP puede contener un nuevo sitio de acoplamiento ERK que aún no se ha determinado.

hCdGAP está fosforilado en vivo sobre residuos de serina y treonina e interactúa con ERK1 / 2

(A) Las células COS-7 que expresan hCdGAP o mCdGAP-1 marcadas con Myc se marcaron con 0,5 mCi / ml de [32 P] PI. Las proteínas se inmunoprecipitaron (IP) utilizando anticuerpos anti-Myc. Las muestras se resolvieron mediante SDS / PAGE y las proteínas radiomarcadas se revelaron mediante autorradiografía (panel superior). La membrana se inmunotransfirió (IB) con anticuerpos anti-Myc para mostrar la cantidad total de CdGAP inmunoprecipitado (panel inferior). (B) La banda de proteína fosforilada correspondiente a hCdGAP se cortó y se sometió a análisis de fosfoaminoácidos. Los fosfoaminoácidos se resolvieron mediante TLC y se detectaron mediante autorradiografía. La migración de los estándares de fosfoaminoácidos está indicada por los círculos punteados: P-S, fosfoserina P-T, fosfotreonina P-Y, fosfotirosina. (C) Se transfectaron células COS-7 con vector vacío, pRK5myc-CdGAP-1 o pRK5myc-hCdGAP. Las proteínas CdGAP se inmunoprecipitaron (IP) usando anticuerpos anti-Myc. La membrana se inmunotransfirió con anticuerpos anti-Myc y anti-ERK1 / 2 (paneles superiores). Los niveles de expresión de proteínas se muestran como controles de entrada (lisados ​​de células) en los paneles inferiores. EV, vector vacío.

Las CdGAP inducen la formación de ampollas en la membrana plasmática de los fibroblastos

La formación de ampollas dinámicas en la membrana, la fragmentación del ADN, la expresión superficial de los marcadores fagocíticos y la condensación de la cromatina son características distintivas de la fase de ejecución bien conservada de la muerte celular programada (apoptosis) a lo largo de la evolución (Wyllie et al., 1980 Lauber et al., 2004). En el presente estudio, encontramos que los CdGAP de ratón y humanos inducen el redondeo celular y la formación de ampollas en la membrana cuando se sobreexpresan en células de fibroblastos COS-7 (Figura 6). Más de la mitad de las células transfectadas que expresan mCdGAP-s, mCdGAP-1 o hCdGAP muestran una protuberancia pseudopodial y ampollas celulares (Figura 6). Las CdGAP se localizan dentro de las ampollas, con filamentos de actina presentes en la periferia de las ampollas celulares (Figura 6K). Aunque las tres CdGAP pueden inducir la formación de ampollas celulares, la morfología de las células que expresan las formas corta o larga de mCdGAP es diferente (Figuras 6C-6J). En las células que expresan mCdGAP-s, las ampollas son mucho más pequeñas en comparación con las ampollas grandes y redondas que emergen de las células que expresan mCdGAP-1 o hCdGAP. Además, el redondeo celular es mayor en las células que expresan las formas largas de CdGAP, lo que sugiere que las colas C-terminales de mCdGAP-1 y hCdGAP son necesarias para mejorar la capacidad de CdGAP para inducir el redondeo celular y la formación de ampollas. Es importante destacar que la sobreexpresión de p50 RhoGAP, otro miembro de la familia de proteínas RhoGAP, no induce la formación de ampollas en la membrana, pero muestra defectos citoesqueléticos de actina (Figuras 6B y 6G), lo que sugiere que la formación de ampollas en la membrana inducida por las proteínas CdGAP no es una consecuencia de la sobreexpresión de una GAP. en celdas. En conjunto, estos datos sugieren que las CdGAP pueden desempeñar un papel novedoso en la apoptosis.

Las CdGAP inducen la formación de ampollas en la membrana plasmática

Las células COS-7 se transfectaron con el vector pRK5 vacío (EV) (A y F), el vector pMT que codifica p50 RhoGAP etiquetado con Myc (B y GRAMO) o pRK5 que codifica hCdGAP con etiqueta Myc (C y H), mCdGAP-l (D y I) o mCdGAP-s (mi, J y K). La actina filamentosa se visualizó con faloidina conjugada con TRITC (FJ), y las proteínas marcadas con Myc se revelaron mediante tinción conjunta con un anticuerpo anti-Myc y mediante inmunofluorescencia indirecta (Ami). La imagen fusionada se produjo utilizando el software Northern Eclipse (K). (L) Análisis cuantitativo del porcentaje de células transfectadas que presentan ampollas en la membrana plasmática.


Archivos suplementarios

Inmovilización covalente y selectiva de proteínas de fusión GST con sondas basadas en fluorofosfonatos

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