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Métodos químicos para detectar la división celular.

Métodos químicos para detectar la división celular.



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Así que he estado trabajando en un proyecto por un tiempo, y hay un mecanismo sobre el que necesito un pequeño consejo.

El proyecto se basa en biología química, así que no te desanimes :)

Teóricamente, en este punto del experimento:

Pongo células (digamos linfáticas o endometriales) en estasis, a través de liopreservación, y ahora, los he sacado de la estasis, a través de la exposición a una sacarosa (trehalosa) a base de medio.

Ahora estoy intentando detectar químicamente el crecimiento mitótico dentro de las células, ¿cómo puedo hacer esto?

Aquí es donde entra la química: mi primer pensamiento fue usar un indicador cromático eso podría fluorescen o irradian en respuesta a la aceleración mitótica, pero todavía no he encontrado una sustancia química adecuada. En la investigación, descubrí que se había hecho un experimento similar con bacterias, y la química dimiristoilfosfatidilcolina Se había utilizado (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina). ¿Funcionaría esto en células de mamíferos? Otra idea fue utilizar una sustancia química que detecte el crecimiento antinatural de la huso fibra y centriolo punto de vista, reaccionando cuando los centriolos entraron en la fase de replicarse. No he podido encontrar ningún producto químico que utilice la replicación de centriolos o las fibras del huso, así que necesito ideas.

Para resumir: Alguien sabe de alguno biocromático indicadores que reaccionan mediante la detección de crecimiento rápido, de mamíferos, mitótico? No necesariamente canceroso y desinhibido, pero rápido que significa 'una velocidad de mitosis que es más rápido que la norma. Preferiblemente, el indicador podría permanecer en estasis por extendido períodos de tiempo.

Si dicho indicador no está disponible (o usted no lo cree), ¿existe un indicador biocromático que reacciona ante la presencia de cualquier tipo de la división celular?

Hay alguna manera para detectar químicamente la división celular?

Soy bienvenido a todas las ideas.


El indicador más común del crecimiento de cualquier tipo de célula (población) que conozco es la cantidad de ADN en esa célula. Hay una serie de tintes (fluorescentes) que se unen al ADN de una manera estequiométrica y, por lo tanto, se pueden usar para determinar la cantidad (relativa) de ADN dentro de una célula (espero que eso sea lo que quiere decir con 'indicador biocromático'). El tinte más común usado de esta manera es probablemente DAPI.

Para determinar qué células se están dividiendo, obviamente necesitará un dispositivo que pueda medir la fluorescencia de cada célula individualmente, por lo que puede ser un microscopio o un citómetro de flujo. Debido a que las células de mamíferos en crecimiento (me parece que eso es lo que quieres ver) multiplican su conjunto completo de cromosomas diploides en la fase S del ciclo celular, puedes discriminar las células en crecimiento de otras por sus cantidades relativas de ADN:

  • Una célula que no crece tiene solo los cromosomas diploides (1x ADN relativo)
  • Una célula en crecimiento tendrá el doble conjunto de cromosomas (2x ADN relativo) si completó la fase S o una cantidad intermedia (1-2x ADN relativo) si actualmente está en fase S

La Figura 1 de este documento (realmente antiguo) también muestra cómo las cantidades de ADN pueden indicar en qué punto del ciclo celular se encuentra una célula (lo que le indica si está creciendo).

Una nota sobre la viabilidad celular:

La tinción de cualquier tipo de célula con DAPI (o la mayoría de los otros tintes que se unen al ADN) probablemente la matará o al menos actuará como un mutágeno muy fuerte. Según su respuesta a mi comentario, esto no debería ser un problema.

Si bien no es realmente parte de su pregunta, mencionó que desea preservar las células mediante lioconservación, lo que básicamente significa secarlas. Debe tener en cuenta que las células de los mamíferos probablemente no sobrevivirán a este proceso (a diferencia de las plantas y algunos invertebrados, no existen mecanismos en las células de los mamíferos para protegerlas contra la pérdida de agua). Sin clasificar primero las células vivas de las muertas, sus mediciones pueden detectar células que se estaban dividiendo antes de la preservación.


INTRODUCCIÓN DE LA UNIDAD

La evaluación de la distribución del ciclo celular y la proliferación celular es importante para estudiar la diferenciación del crecimiento celular, la senescencia y la apoptosis. Esto permite investigar los mecanismos básicos subyacentes, así como evaluar la eficacia terapéutica de los fármacos contra el cáncer. Durante la progresión del ciclo celular, las células en proliferación experimentan secuencialmente una transición de las fases G1 & # x02192S & # x02192G2 & # x02192M para la síntesis de ADN, preparación de la división celular y posterior proceso de mitosis (Malumbres y Barbacid, 2009). Sin embargo, en determinadas circunstancias, las células pueden entrar en la fase G0, en la que las células no se dividen ni se preparan para la proliferación. Estas células en reposo se caracterizan por tener una maquinaria de ciclo celular mínima y mantener funciones celulares especializadas en lugar de proceder a la proliferación celular. Este estado de reposo también se conoce como inactivo (Zetterberg et al., 1995).

El enfoque más temprano y simple para analizar el estado del ciclo celular es medir el contenido de ADN celular en un solo punto de tiempo (Darzynkiewicz y Huang, 2004). Esto revela una instantánea del estado del ciclo celular entre 3 grupos distintos (es decir., G0 / G1 (2n), S (2n

4n) y fase G2 / M (4n), respectivamente). En 1969, se describió por primera vez el método de tinción de feulgen-ADN para analizar la distribución del ciclo celular (Van Dilla et al., 1969). Desde entonces, se han desarrollado muchos colorantes de ADN fluorescentes para el análisis multiplex del contenido de ADN celular y otros marcadores relacionados con la proliferación (Tabla 1). Sin embargo, este método es insuficiente para comprender el estado detallado del ciclo celular porque el contenido de ADN por sí solo no puede distinguir las células en reposo / inactivo (G0) de las células en fase G1.

Tabla 1

Listas de tintes de ADN fluorescentes comunes

Nombre comercialExmaxEmmaxEx. LáserFabricante
DAPI345455UVVarios
Hoechst 33342 * 350461UVVarios
Yoduro de propidio (PI)535617UV, 488, 532 o
561 nanómetro
Varios
7-AAD546647488 o 532 nmVarios
DRAQ5 * 647681/697633 nanómetroVarios
DRAQ7599/644694633Varios
FxCycle TM Violeta358461405 nanómetroTecnologías de vida
Vybrant & # x000ae DyeCycle TM Violet * 369437UV o 405 nmTecnologías de vida
Vybrant & # x000ae DyeCycle TM Verde * 506534488 millas náuticasTecnologías de vida
Vybrant & # x000ae DyeCycle TM Naranja * 519563488 o 532 nmTecnologías de vida
Vybrant & # x000ae DyeCycle TM Ruby * 638686561 o 633 nmTecnologías de vida
SYTOX & # x000ae Azul444480405 nanómetroTecnologías de vida
SYTOX & # x000ae Verde504523488 millas náuticasTecnologías de vida
SYTOX & # x000ae Naranja547570488 o 532 nmTecnologías de vida
SYTOX & # x000ae AADvanced TM546647488 o 532 nmTecnologías de vida
SYTOX & # x000ae Rojo640658633 nanómetroTecnologías de vida
FxCycle TM Far Red640658633 nanómetroTecnologías de vida

Para superar esta limitación, se han desarrollado algunos métodos alternativos. En primer lugar, las fracciones de células en reposo / quiescentes y en proliferación pueden identificarse mediante proteínas asociadas a la proliferación y / o antígenos de proliferación nuclear como Ki-67 y antígeno nuclear de células en proliferación (PCNA). El antígeno Ki-67 rara vez se detecta en la fase G0, se expresa altamente en la región nuclear de las células en proliferación (máximo en las fases G2 y M temprana) y se degrada rápidamente durante los procesos de anafase y telofase de la mitosis (Gerdes et al., 1984). Asimismo, el PCNA es un buen marcador para la proliferación de células y se concentra en la fase S (Kurki et al., 1986), que es útil para separar las células de la fase S. En segundo lugar, la cuantificación del ARN intracelular mediante la doble tinción Hoechst 33342 / Pyronin Y puede ser una forma alternativa de estudiar el estado del ciclo celular porque las células altamente proliferantes generalmente contienen niveles más altos de ARN en comparación con las células en reposo / inactivo. Históricamente, Pyronin Y se ha utilizado ampliamente para la observación microscópica de ARN celular en combinación con verde de metilo (Scott, 1967). Su aplicación fue ampliada a la citometría de flujo por Howard Shapiro en 1981 y definida por Zibgniew Darzynkiewicz en 2004 (Darzynkiewicz et al., 2004 Shapiro, 1981). En esta unidad, se describen dos técnicas básicas de citometría de flujo para evaluar el estado del ciclo celular a través de la determinación de Ki-67 / ADN (Protocolo básico 1) y la cuantificación de ARN intracelular (Protocolo básico 2).


Resultados

Detección de genes de división celular

Los 14 genes implicados en los períodos C y D de la división celular se dividieron en dos grupos distintos. El primer grupo incluyó nueve genes sobreexpresados ​​(nrdAB, nrdA, nrdB, nrdD, ftsZA, ftsZ, ftsA, ftsQ, y ftsN), que puede estimular la síntesis de dNTP y E. coli montaje divisorio 21. Los genes del segundo grupo incluían los expresados ​​débilmente nrdAB, nrdA, nrdB, y nrdD y sobreexpresado sulA, minC, minD, minE, y ftsH. Estos genes pueden perturbar la síntesis de dNTP y el ensamblaje del anillo Z 36,37, por lo que participan en la prolongación de la división celular.

Como se ilustra en la Fig.1, la sobreexpresión independiente de nrdAB, nrdA, nrdB, nrdD, ftsZA, ftsZ, ftsA, ftsQ, y ftsN en E. coli División celular acortada JM109 (datos suplementarios 1 y 2). Como resultado, se redujeron los períodos de división celular, la longitud celular media (MCL), el área superficial media y el volumen celular medio (MCV). El SSA, recuento celular (c.f.u), crecimiento celular (OD600) y el peso de las células secas (DCW) aumentaron. Además, el ancho de celda medio (MCW) no se modificó (Fig. 1e, f, Figs. Suplementarias 1A, B y 4A). Sin embargo cuando nrdAB (o ftsZA) se sobreexpresó, se observó una diferencia obvia en la morfología celular. En comparación con la cepa de control, los períodos de división celular, el área de superficie media, el VCM de las cepas modificadas genéticamente que sobreexpresan nrdAB (o ftsZA) disminuyeron en un 39,73% (o 43,75%), 31,66% (o 41,53%) y 40,35% (o 52,94%), respectivamente (Fig. 1a-d, Fig. 3A complementaria). Además, la SSA, c.f.u, OD600, y DCW aumentaron en un 14,69% (o 24,25%), 15,73% (o 25,84%), 38,98% (o 37,29%) y 38,98% (o 37,29%), respectivamente (Fig.1c, d, Figs complementarios. 5A y 7A). Estos resultados indicaron que sobreexpresar nrdAB y ftsZA podría acortar de manera eficiente los períodos C y D de división celular, respectivamente.

a, B Efecto del acortamiento de los períodos C y D de la división celular sobre la división celular. C, D Efecto de acortar los períodos C y D de división celular sobre el área de superficie específica (SSA) y el volumen celular medio (MCV), respectivamente. mi, F Confirmación de las variaciones morfológicas de todas las cepas diseñadas mediante microscopía electrónica de barrido de emisión archivada (FESEM). Se destacó el color rosa de FESEM. Las imágenes originales se encogieron en la esquina superior derecha de las imágenes ampliadas. a, B Los diagramas de caja definen los mínimos, máximos, centro y límites de la caja. mi, F La barra de escala es de 5 μm. Significado (pag-valor) fue evaluado por dos caras t-prueba en comparación con CT. aD Los valores se expresaron como media ± desviación estándar. de tresnorte = 3) réplicas biológicas independientes. La información para cada gen se proporcionó en la Nota complementaria 1. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Como se muestra en la Fig.2, la expresión débil independiente de nrdAB, nrdA, nrdB, y nrdD en el correspondiente E. coli Cepas mutantes JM109 y la sobreexpresión independiente de sulA, minC, minD, minE, y ftsH en E. coli JM109 podría prolongar la división celular (Datos suplementarios 1 y 2). Como resultado, aumentaron los períodos de división celular, el MCL, el área de superficie media y el MCV. La SSA, c.f.u, OD600y DCW disminuyeron. Además, la expresión de esos genes no cambió la MCW (Fig. 2e, f, Figs. Suplementarias 2A, B, 4B). Entre estas cepas, se mostró una diferencia obvia en la morfología celular por la expresión débil de nrdA y sobreexpresión de sulA. En comparación con la cepa de control, los períodos de división celular, el área de superficie media, el VCM de las cepas manipuladas con expresión débil de nrdA (o sobreexpresión de sulA) aumentaron en un 124,6% (o 271,8%), 281,21% (o 776,87%) y 384,57% (o 960,62%), respectivamente (Fig. 2a – d, Fig. 3B complementaria). Además, la SSA, c.f.u, OD600, y DCW disminuyeron en un 21,41% (o 17,74%), 11,55% (o 31,05%), 4,65% (o 5,81%) y 4,65% (o 5,81%), respectivamente (Fig.2c, d, Fig. complementaria. 6A, 7B). Comparado con E. coli JM109 con expresión débil de nrdA, nrdAB, nrdB, y nrdD, el período C de E. coli JM109 con eliminación de nrdA, nrdAB, nrdB, y nrdD se incrementó en 102,77%, 51,58%, 59,28% y 18,53%, respectivamente (Figura complementaria 3C y Nota complementaria 2). Estos resultados sugirieron que la expresión débil de nrdA y sobreexpresión de sulA podría prolongar de manera eficiente los períodos C y D de división celular, respectivamente.

a, B Efecto de la prolongación de los períodos C y D de la división celular sobre la división celular. C, D Efecto de prolongar los períodos C y D de la división celular sobre el área de superficie específica (SSA) y el volumen celular medio (MCV). mi, F Confirmando las variaciones morfológicas de todas las cepas diseñadas por la FESEM. Se destacó el color azul de FESEM. Porque las imágenes originales se encogieron en la esquina superior derecha de las imágenes ampliadas. En nrdA /nrdA, nrdAB /nrdAB, nrdB/∆nrdB, y nrdD /nrdD mutantes, nrdA, nrdAB, nrdB, y nrdD se expresaron débilmente por IPTG de baja concentración (10 µM), respectivamente. a, B Los diagramas de caja definen los mínimos, máximos, centro y límites de la caja. mi, F La barra de escala es de 5 μm. Significado (pag-valor) fue evaluado por dos caras t-prueba, en comparación con CT. aD Los valores se muestran como media ± desviación estándar. de tresnorte = 3) réplicas biológicas independientes. La información para cada gen se proporcionó en la Nota complementaria 1. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Finalmente, investigamos el efecto de nrdAB y ftsZA sobreexpresión sobre el acortamiento de la división celular y el efecto de la nrdA expresión y sulA sobreexpresión en la prolongación de la división celular. Como se muestra en la Fig.3a, b, la sobreexpresión simultánea de nrdAB y ftsZA aumentó el SSA a 4,12 μm -1, y la expresión débil de nrdA y sobreexpresión de sulA aumentó el MCV a 56,2 μm 3. Sin embargo, la coexpresión de nrdAB + ftsZAQ y nrdAB + ftsZAQN no acortó los períodos C y D ni aumentó el SSA, c.f.u u OD600 (Fig. Suplementaria 8A, B, 9A). Por lo tanto, la nrdAB + ftsZA y nrdA + sulA Se eligieron grupos para acortar o prolongar los períodos C y D de división celular, respectivamente (Fig. 3c-f).

a Combinando los períodos C y D para acortar la división celular. B Combinando los períodos C y D para prolongar la división celular. C Efecto de la división celular normal sobre la morfología celular y los períodos C + D. D Efecto del acortamiento de la división celular sobre la morfología celular y los períodos C + D. mi Efecto de la prolongación de la división celular sobre la morfología celular y los períodos C + D. F Diseñar los períodos C + D de división celular para mejorar el área de superficie específica (SSA) o el volumen celular medio (MCV). Significado (pag-valor) fue evaluado por dos caras t-prueba, en comparación con CT. a, B Los valores se muestran como media ± desviación estándar. de tresnorte = 3) réplicas biológicas independientes. Los datos de origen subyacentes a las Fig. 3a, b se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Construyendo las herramientas básicas para impulsar la división celular

Para lograr un control espacial, temporal y reversible de E. coli SSA y MCV, tres herramientas básicas de regulación de la división celular basadas en optogenética, una herramienta de activación de luz azul (BLAT), una herramienta de represión de luz azul (BLRT) y una herramienta de activación de luz NIR (NRAT), fueron diseñadas y construidas ( Fig.13 complementaria).

La construcción de BLAT y BLRT sigue una estrategia previamente informada 38. Para construir un BLAT, se diseñaron y ensamblaron dos unidades (Fig.4a): una unidad de optogenética azul (BOU) para expresar la proteína sensible a la luz EL222, y una unidad informadora de activación para reemplazar la región de unión a LuxR con una región de unión a EL222 superponiendo la región −35 (E. coli consenso -35 y -10 regiones) del promotor LuxI 38. En este BLAT, EL222 puede unirse al promotor inducible por luz azul después de la iluminación con luz azul y luego inducir la expresión génica mediante el reclutamiento de la ARN polimerasa. Para construir un BLRT, el promotor J23119 modificado se convirtió en un represor transcripcional colocando la caja J23119 entre y superponiendo parcialmente las regiones consenso -35 y -10 del promotor constitutivo 38, dando como resultado una unidad informadora de represión (Fig. 4b), que luego se combinó con la unidad de optogenética azul (BOU). Para construir una NRAT, se diseñaron y ensamblaron dos unidades: una unidad de luz infrarroja cercana para expresar constitutivamente la bphS, bphO, yhjH, mrkH genes, y una unidad de activación de infrarrojo cercano con el PAGmrkA promotor (Fig. 4C). En esta NRAT, GTP se convierte en c-di-GMP utilizando las proteínas BphS y BphO, y luego c-di-GMP puede ser degradado por la proteína YhjH. Finalmente, la proteína MrkH puede unirse a c-di-GMP para activar la proteína MrkH dependiente PAGmrkA promotor 39.

aC El diagrama esquemático de BLAT (luz azul), BLRT (luz azul) y NRAT (luz NIR), respectivamente. Paneles a y B están adaptados de Jayaraman et al. 38. DF Activación de la fluorescencia con BLAT, BLRT y NRAT en la oscuridad, luz azul de 0,8 W / cm 2 y luz NIR, respectivamente. gramoI Se montaron LED de luz azul o luz NIR en la parte inferior de una fotomáscara con una configuración para iluminación de patrón. Se colocaron máscaras con dibujos de panda rojo, verde, azul y chino hechas de papel de aluminio en la parte superior de la fotomáscara para iluminar la placa de cultivo. En esta configuración, las fotomáscaras se colocaron en la parte inferior de la ingeniería E. coli-placa de cultivo con BLAT, BLRT y NRAT, respectivamente. PAGJ23119: promotor constitutivo PAGlux: promotor de detección de quórum PAGmrkA: Promotor EL222 dirigido a MrkH: proteína sensible a la luz de Erythrobacter litoralis bphS: una c-di-GMP diguanilato ciclasa de Rhodobacter sphaeroides bphO: una hemo oxigenasa de Rhodobacter sphaeroides yhjH: c-di-GMP PDE de E. coli mrkH: un factor de transcripción de Klebsiella pneumoniae. Los diagramas de caja definen los mínimos, máximos, centro y límites de la caja. DF norte los valores se muestran como media ± desviación estándar. de tresnorte = 3) réplicas biológicas independientes. Los datos de origen subyacentes a la Fig. 4d – i se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se evaluaron los rendimientos de BLAT, BLRT y NRAT. La abundancia de mKate (BLAT) y BFP (NRAT) se incrementó en 9,3 y 10,5 veces con iluminación de 0,8 W / cm 2 de luz azul (Fig. 4d) y 0,8 W / cm 2 de luz NIR (Fig. 4f) , respectivamente, pero la abundancia de GFP (BLRT) se redujo en 15,2 veces con iluminación con 0,8 W / cm 2 de luz azul (Fig. 4e) en comparación con la abundancia correspondiente de la condición de oscuridad. Los genes de interés (GOI) de BLAT y NRAT mostraron una mayor abundancia, pero la abundancia de BLRT GOI disminuyó con el aumento del tiempo de iluminación (0-14 h), la intensidad (0-0,8 W / cm 2) y el pulso ( 0-100%) (Figuras complementarias 14A-C, 17A-C y 20A-C). Luego, se utilizaron las bioimágenes en la Fig. 4g – i para rojo, verde, azul y panda con una configuración para mostrar la especificidad espacial de BLAT, BLRT y NRAT. Para la especificidad temporal de BLAT, BLRT y NRAT, la activación de la transcripción reversible en β-galactosidasa o β-glucuronidasa se presentó mediante un interruptor ON-OFF-ON o OFF-ON-OFF bajo control BLAT, BLRT o NRAT, respectivamente (Figuras complementarias 15A, B, 18A, B y 20D).

Para obtener aún más una potente herramienta inducible por luz, optimizamos BLAT, BLRT y NRAT, respectivamente. En BLAT, la longitud del sitio de unión de EL222 y el nivel de expresión de EL222 se modificaron para controlar la abundancia de mKate y, por lo tanto, los resultados mostraron una activación de 23,5 veces en la abundancia de mKate (Fig. 16A-C complementaria). En BLRT, se construyó una biblioteca de promotores de los hexámeros -35 y -10 y se examinó para ajustar el rango dinámico de los promotores bacterianos y, por lo tanto, los resultados revelaron una represión de 53 veces en la expresión de GFP del grupo aB (TTGACA / GATAAT) ( Fig. Suplementaria 19A, B). En NRAT, la fuerza RBS de yhjH se optimizó para regular los niveles de c-di-GMP y, por lo tanto, los resultados mostraron un aumento de 28,6 veces en la abundancia de BFP (Fig. 21A complementaria). Además, estas tres herramientas optogenéticas no fueron invasivas para el crecimiento celular bajo luz azul o NIR (Fig. 22A-C complementaria).

Las herramientas optogenéticas podrían regular eficazmente genes bacterianos endógenos. BLAT, BLRT y NRAT se introdujeron en E. coli JM109 para reemplazar las proteínas fluorescentes y controlar espaciotemporalmente la división celular. En comparación con la cepa de control, cuando se utilizó BLAT para acortar los períodos C + D de división celular, la SSA se incrementó 1,26 veces (Fig. 23A complementaria). Además, cuando se usó BLAT para prolongar los períodos C y D de división celular, el MCV se incrementó en 3,68 veces y 10,36 veces, respectivamente (Fig. 23A complementaria). Del mismo modo, cuando se introdujeron BLRT y NRAT en E. coli JM109, los períodos C y D de división celular aumentaron y disminuyeron, respectivamente (Fig. 23B, C complementaria). Para confirmar aún más las propiedades universales de estas herramientas optogenéticas, se introdujeron BLAT, BLRT y NRAT en la cepa productora de lactato. E. coli GL0002 40 y cepa productora de piruvato E. coli F0601 40, también se detectaron cambios similares en el período C y D de la división celular, respectivamente (Fig. 24A complementaria). Juntos, estos resultados demostraron que las herramientas optogenéticas exhibían una buena aplicabilidad para la regulación de la división celular.

Mejora de la producción de acetoína al acortar la división celular.

La acetoína, un aromatizante y fragancia para alimentos, se usa ampliamente en las industrias alimentaria, farmacéutica y química 41. Un ingeniero E. coli La cepa D1 se construyó sobreexpresando constitutivamente budA, brote, y nox genes en la vía biosintética de la acetoína. En base a esto, la cepa diseñada produjo 13,5 g L -1 de acetoína (Fig. 5A, D, Datos suplementarios 1 y 2).

a El diagrama esquemático de la vía de biosíntesis de acetoína en E. coli D1. B El diagrama esquemático de BANA que contiene BLAT y NRAT. C Mejora de la producción de acetoína mediante la regulación BANA. BLAT se utilizó para controlar nrdAB y ftsZA, y al mismo tiempo NRAT controlado rpoS. D Efecto de la combinación de iluminación sobre los períodos C + D y producción de acetoína. H, M y L fueron 0,8, 0,3 y 0,2 W / cm 2, respectivamente (Fig. 27A-C complementaria). Los genes en los períodos C + D de división celular se expresaron constitutivamente en E. coli D1, resultando en E. coli D2. los rpoS gen se expresó constitutivamente en E. coli D2, resultando en E. coli D3. Los genes en los períodos C + D de división celular fueron controlados por luz azul en E. coli D1, resultando en E. coli DB5 (Blue-H-M-M representó 0,8 W / cm 2 de luz azul en la fase I y 0,3 W / cm 2 de luz azul en la fase II y la fase III). los rpoS gen fue controlado por NIR-light en E. coli DB5, lo que resulta en E. coli DN4 (NIR-MH representa 0,3 W / cm 2 NIR-luz en la fase II y 0,8 W / cm 2 NIR-luz en la fase III (Fig. Suplementaria 30A, B y Nota suplementaria 6). La figura insertada era el color de la creatina reacción. mi Producción de acetoína con ingeniería E. coli DN4 controlado por estimulación lumínica durante la fermentación por lotes alimentados. F Efecto del acortamiento de la división celular sobre la morfología celular durante la producción de acetoína. los rpoS gen se expresó constitutivamente en E. coli D1, resultando en E. coli DQ260. La barra de escala para c, g, k, o son 5 μm. Para d, h, l, p son 0,2 μm. Para a, e, i, m son 5 μm. D, mi Los valores se muestran como media ± desviación estándar. por norte = 3 réplicas biológicas independientes. Glu glucosa, G6P glucosa-6-fosfato, PYR piruvato, PEP fosfoenolpiruvato, AcCoA acetil-CoA, α-acLA α-acetolactato, α-ackA acetato quinasa A, adhE alcohol deshidrogenasa, ldhA lactato deshidrogenasa, poxB piruvato oxidasa, pflB piruvato-formiato liasa pta fosfato acetil transferasa, budA α-acetolactato sintasa, brote α-acetolactato descarboxilasa, nox NADH oxidasa. Significado (pag-valor) fue evaluado por dos caras t-prueba, en comparación con E. coli D1. Los datos de origen subyacentes a las Fig. 5d – f se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Entonces, el estado de la división celular y la robustez de la ingeniería E. coli Se analizaron D1. Como se muestra en la Fig. 5D y en la Fig. 28B complementaria, se encontró que el período C + D de división celular (E. coli D1) se prolongó en un 33,09% en comparación con E. coli F0601. Como resultado, la SSA y la viabilidad celular relativa de E. coli D1 se redujo en un 6,89% y un 50,5%, respectivamente. Estos resultados demostraron que prolongar el período C + D de división celular disminuyó el SSA y luego alteró la viabilidad celular, lo que condujo al cese del crecimiento celular y potencialmente a la producción de acetoína. Para mejorar el crecimiento celular y mejorar la robustez de la cepa, el proceso de fermentación de la acetoína se dividió en tres fases mediante la introducción de estrategias optogenéticas para acortar la división celular: (1) fase de acortamiento para acortar la división celular y aumentar la SSA mediante la expresión de alto nivel de nrdAB + ftsZA (2) fase de cooperación para equilibrar el crecimiento celular y la producción de acetoína expresando nrdAB + ftsZA a un nivel moderado y estimulando la expresión del rpoS 42 y (3) fase de defensa para mejorar la robustez de la deformación expresando nrdAB + ftsZA a un nivel moderado y rpoS en un nivel alto (Fig. 5c, Fig. 25A complementaria, B, Nota complementaria 3 y Datos complementarios 4).

Para sintonizar espacio-temporal estas tres fases, se construyó un sistema de activación de luz azul y activación de luz NIR (BANA) combinando BLAT y NRAT (Fig. 5b). Luego, confirmamos las funciones similares de la especificidad dosis-dependiente y espacio-temporal de BANA mediante la implementación de los experimentos de intensidad de iluminación, pulso, bioimagen y abundancia de GOI, respectivamente (Fig. 26A-C complementaria). Además, BANA se introdujo en E. coli D1 para aumentar la producción de acetoína mediante la regulación espacio-temporal de la expresión de nrdAB, ftsZA, y rpoS. En base a esto, las tres fases mencionadas anteriormente se lograron manipulando la intensidad y el tiempo de la iluminación con luz azul y con luz NIR, respectivamente (Fig. 5c, Fig. 27A-C complementaria). Esta manipulación condujo a la formación de E. coli DN4. Como resultado, el período C + D de E. coli DN4 se redujo en un 35,56% en comparación con E. coli D1, mientras que la SSA, la viabilidad celular relativa y la concentración inhibidora semimáxima aumentaron en un 20,39%, 62,18% y 46,23%, respectivamente (Fig. 5d, f, Fig. Complementaria 28A, B). Estos resultados llevaron a un aumento del 131,1% en el título y la productividad de acetoína en E. coli DN4 frente a los de E. coli D1, respectivamente (Fig. 5d). Cuando este cultivo se amplió a un fermentador de 5 L, el título de acetoína, la productividad y la DO600 de E. coli DN4 en condiciones de luz se incrementó a 67,2 g L -1, 0,93 g L -1 h -1 y 64,97, respectivamente, que fueron 39,19, 39,19 y 16,43% más altos que los de E. coli D1, 15,17, 15,17 y 6,02% mayor que el de E. coli D3, 41,5, 41,5 y 23,78% mayor que el de E. coli DN4 en condiciones de oscuridad, respectivamente (Fig. 5e, Tabla 1). Además, en base a la intensidad de fluorescencia y el porcentaje de densidad de fluorescencia en fermentadores de 5 y 10 L, se activó una expresión de fluorescencia similar en matraces de agitación de 250 ml. Estos resultados indicaron la aplicabilidad fina de las incrustaciones y la fermentación de alta densidad (Figuras complementarias 31-33 y Nota complementaria 4).

Aumentar la producción de poli (lactato-co-3-hidroxibutirato) (PLH) al prolongar la división celular

PLH es un polímero sintético biodegradable y biocompatible que se acumula como cuerpos de inclusión en microorganismos 43. Nosotros diseñamos E. coli DQ0, en el que el phaA, phaB, phaC, y pct los genes implicados en la vía PLH se sobreexpresaron constitutivamente. El resultado analítico mostró que su contenido de PLH estaba a un nivel de 11,5% en peso (Fig. 6a, d, Datos suplementarios 1 y 2). Luego, se analizó el estado de la división celular (Fig. Complementaria 34A, B). Encontramos que el período C + D de división celular (E. coli DQ0) se prolongó en un 17,95% (Fig. 6d). Como resultado, el MCV se incrementó en 9.38%, pero c.f.u de E. coli DQ0 se redujo en un 8,9% respecto al de E. coli GL0002 (Fig. 6d, Fig. Suplementaria 39A, C). Estos resultados indicaron que la producción de PLH estaba limitada por el MCV y los recuentos de células. Para resolver estas limitaciones en la fermentación de PLH, el proceso de biosíntesis de PLH se dividió en tres fases mediante la introducción de estrategias optogenéticas para prolongar la división celular: (1) acortar la división celular para aumentar el recuento celular mediante la expresión de nrdAB, ftsZA, y nrdA (2) fase de cambio de tiempo para aumentar el contenido de PLH optimizando el tiempo de cambio de luz oscura a azul y (3) prolongando la división celular para aumentar el MCV estimulando la expresión de sulA y disminuyendo la expresión de nrdA (Fig. 6c, Fig. Complementaria 34A, B).

a El diagrama esquemático de la vía de biosíntesis de PLH en E. coli DQ0. B El diagrama esquemático de BARNA que contiene BLRT y BANA. C Incrementar la producción de PLH por regulación BARNA. Se utilizaron BLRT, BLAT y NRAT para controlar nrdAB + ftsZA, sulA, y nrdA, respectivamente. D Efecto de la combinación de luz azul y luz NIR sobre el contenido de PLH y los períodos C + D. H, M y L fueron 0,8, 0,3 y 0,2 W / cm 2, respectivamente (Figuras complementarias 37A, B, 38A, B). La figura insertada fue nueve grupo de combinación (E. coli DQ1 – DQ9) con matriz ortogonal por intensidad de iluminación de luz azul y NIR. mi Producción de PLH con ingeniería E. coli DQ8 controlado por estimulación de luz durante la fermentación por lotes alimentados. Las fases I, II y III se controlaron con luz NIR de 0,8 W / cm 2, luz NIR de 0,8 W / cm 2, luz azul 0,8 W / cm 2 y luz NIR de 0,3 W / cm 2, respectivamente. F Efecto de prolongar la división celular sobre la morfología celular durante la producción de PLH. los nrdA y sulA genes se expresaron constitutivamente en E. coli DQ0, resultando en E. coli DQ270 y E. coli DQ271, respectivamente. La barra de escala para c, h, m, r es de 10 μm. La barra de escala para d, i, n y s es de 0,5 μm. Para e, j, o y t es 0.2 μm. Para a, f, kyp es 5 μm. D, mi los valores se muestran como media ± desviación estándar. de tresnorte = 3) réplicas biológicas independientes. Glu glucosa, G6P glucosa 6-fosfato, PYR piruvato, LA lactato, PEP fosfoenolpiruvato, AcCoA acetil-CoA, aceCoA acetoacetil-CoA, 3HBCoA 3-hidroxibutiril-CoA, LAcoA lactil-coA, ackA acetato quinasa A, adhE alcohol deshidrogenasa, phaA β-cetotiolasa, phaB acetoacetil-CoA reductasa, phaC PHA sintasa, pct propionil-CoA transferasa. Significado (pag-valor) fue evaluado por dos caras t-prueba, en comparación con E. coli DQ0. Los datos de origen subyacentes a las Fig. 6d – f se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para regular espacio-temporal estas tres fases, se construyó un sistema de activación-represión de luz azul y activación de luz NIR (BARNA) combinando BANA y BLRT (Fig. 6b). Luego, confirmamos las funciones similares de la especificidad espacio-temporal y dependiente de la dosis de BARNA mediante la realización del pulso de iluminación, la intensidad, la bioimagen y los experimentos de abundancia de GOI (Fig. Complementaria 35A, 36A, B). Además, BARNA se introdujo en E. coli DQ0 para mejorar la producción de PLH controlando espaciotemporalmente la expresión de nrdAB, ftsZA, nrdA, y sulA genes. En base a esto, las tres fases mencionadas anteriormente se lograron ajustando la intensidad y el tiempo de iluminación (Fig. 6c, Fig. Complementaria 37A, B y complementaria 38A, B). Esta manipulación condujo a la formación de E. coli DQ8. Como resultado, en comparación con E. coli DQ0, el período C + D de E. coli DQ8 se prolongó 1,96 veces, mientras que el grosor de la pared celular se redujo en un 18,6% (Fig. 6D, F). Además, el MCV y c.f.u se incrementaron en 13,65 veces y 1,16 veces, respectivamente (Fig. Complementaria 39A, C). Estos resultados llevaron a que el contenido de PLH, DCW y el título de PLH aumentaran a 38.5% en peso, 7.41 g L -1 y 2.85 g L -1, respectivamente, que fue 234.78, 36.96, 359.68% más alto que el de E. coli DQ0 (Fig. 6d, f, Fig. Complementaria 39B). Después de eso, el tiempo de cambio en la oscuridad se optimizó antes de comenzar la fermentación, y el contenido de PLH se incrementó a 47,5% en peso (Fig. 39D complementaria). Cuando este cultivo se amplió hasta el fermentador de 5 L, el título, el contenido y el DCW de PLH de E. coli DQ8 en condiciones de luz fueron 14.31 g L -1, 53.8% en peso y 26.6 g L -1, que fueron 137.71, 100.97 y 18.33% más altos que los de E. coli DQ0, 34.87, 22.66 y 9.96% mayor que el de E. coli DQ280, 114.22, 86.87 y 14.61% más alto que el de E. coli DQ8 en condiciones de oscuridad, respectivamente (Fig. 6e, Tabla 2).


Detección inmunofluorescente de dos análogos de timidina (CldU e IdU) en tejido primario.

La medición precisa de la división celular es un desafío fundamental en la biología experimental que se vuelve cada vez más compleja cuando se analizan células que se dividen lentamente. Los métodos establecidos para detectar la división celular incluyen visualización directa por microscopía continua en cultivo celular, dilución de colorantes vitales como carboxifluoresceína di-aetato succinimidil éster (CFSE), inmunodetección de antígenos mitógenos como ki67 o PCNA y análogos de timidina. Thymidine analogues can be detected by a variety of methods including radio-detection for tritiated thymidine, immuno-detection for bromo-deoxyuridine (BrdU), chloro-deoxyuridine (CldU) and iodo-deoxyuridine (IdU), and chemical detection for ethinyl-deoxyuridine (EdU). We have derived a strategy to detect sequential incorporation of different thymidine analogues (CldU and IdU) into tissues of adult mice. Our method allows investigators to accurately quantify two successive rounds of cell division. By optimizing immunostaining protocols our approach can detect very low dose thymidine analogues administered via the drinking water, safe to administer to mice for prolonged periods of time. Consequently, our technique can be used to detect cell turnover in very long-lived tissues. Optimal immunofluoresent staining results can be achieved in multiple tissue types, including pancreas, skin, gut, liver, adrenal, testis, ovary, thyroid, lymph node, and brain. We have also applied this technique to identify oncogenic transformation within tissues. We have further applied this technique to determine if transit-amplifying cells contribute to growth or renewal of tissues. In this sense, sequential administration of thymidine analogues represents a novel approach for studying the origins and survival of cells involved in tissue homeostasis.


Resultados y discusión

Labeling of Cellular DNA with EdU.

Cells incorporate 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) and 5-iodo-2′-deoxyuridine (IdU) into their DNA in the place of 5-methyl-2′-deoxyuridine (thymidine). We reasoned that 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) should also be efficiently incorporated into replicating DNA and its terminal alkyne group should be available to react with organic azides in the major groove of the double helix, without steric hindrance. We synthesized EdU and fluorescent azide derivatives required for its detection in cells by using click chemistry (Fig. 1). Cells labeled in culture with 10 μM EdU overnight showed very intense nuclear staining after reaction with Alexa568-azide under Cu(I)-catalyzed click reaction conditions (Fig. 2 B, mi, y H). In contrast, cells not labeled with EdU displayed no detectable staining if subjected to the same fixation and staining conditions as EdU-labeled cells (Fig. 2 A, D, y GRAMO). EdU staining was greatly reduced in cells in which DNA replication was blocked by treatment with hydroxyurea (Fig. 2 C, F, y I ver también J–M), demonstrating that the nuclear staining in EdU-labeled cells is the result of EdU incorporation during DNA synthesis. Also, in synchronized HeLa cells, the extent and intensity of DNA labeling after a pulse of EdU during S phase correlates with the EdU concentration and the length of the pulse (data not shown). EdU has been previously evaluated as an antiviral compound (7). These early studies concluded that EdU was not incorporated into bacterial and phage DNA (8) its incorporation into eukaryotic DNA, however, was not investigated. We find that EdU is strongly incorporated into the DNA of proliferating mammalian cells. EdU is also incorporated into DNA replicated in vitro en Xenopus egg extracts (data not shown, see Materiales y métodos) by simple addition to the cycling extract preparation.

Use of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) to label DNA in cells. (A) Structure of 5-ethynyl-2′-deoxyuridine, a thymidine analogue that carries a terminal alkyne group instead of a methyl in the 5 position of the pyrimidine ring. (B) Schematic of the click reaction for detecting EdU incorporated into cellular DNA. The terminal alkyne group, exposed in the major groove of the DNA helix readily reacts with an organic azide (R can be any fluorophore, hapten, electron-dense particle, quantum dot, etc.) in the presence of catalytic amounts of Cu(I). (C) Structures of the fluorescent azides used in the present study. Unlike azide 2, azide 3 is cell-permeable, allowing cells to be stained while alive, without fixation and/or permeabilization. Fluorescein azide 4 can be easily prepared in large amounts by using inexpensive starting materials. See text and Materiales y métodos for details.

Detection of EdU incorporated into the DNA of cultured NIH 3T3 cells (A–M) and HeLa cells (N–P) by fluorescence microscopy. NIH 3T3 cells were incubated in media without EdU (A, D, GRAMO, J, y L), media supplemented with10 μM EdU (B, mi, y H) or media with 10 μM EdU and 10 mM hydroxyurea to block DNA synthesis (C, F, I, K, y METRO). En A–M, the cells were fixed and then reacted with 10 μM Alexa568-azide (Fig. 1 C, compound 2) for 10 min. The cells were then counterstained with Hoechst to reveal cellular DNA, washed, and imaged by fluorescence microscopy and differential interference contrast (DIC). Note the strong specific and low nonspecific azide stain in the presence (H) and absence (GRAMO) of EdU, respectively. Not all nuclei in H are labeled after overnight incubation with EdU, suggesting that only cells that went through S phase became labeled. Blocking DNA replication with hydroxyurea abolishes EdU incorporation almost completely (I). If cells labeled with EdU in the presence of hydroxyurea are photographed with longer exposure times (3-s exposure time in L y METRO, compared with 40-ms exposure time for G–I under otherwise identical illumination and camera settings), low levels of EdU incorporation can be seen in a small fraction of the hydroxyurea-treated cells. (N–P) Still images from a time-lapse recording of EdU staining of live cells by using the cell-permeable TMR-azide (Fig. 1 C, compound 3). Live HeLa cells labeled with 10 μM EdU were stained with 500 nM TMR-azide in the presence of Cu(I) in PBS. Time is shown in minutes in the upper right corners of M–P. Note that Cu(I) is cytotoxic and the cells do not survive the staining reaction. See text and Materiales y métodos for details.

The [3 + 2] cycloaddition reaction used to detect EdU in cells is catalyzed by Cu(I) ions. Because of the low solubility of Cu(I) salts, Cu(I) is often introduced in [3 + 2] cycloaddition reactions in a liganded form (9). We found that the best EdU staining was obtained by generating Cu(I) from Cu(II) en el lugar, using ascorbic acid as reducing agent. The intensity of the staining obtained was proportional to the concentration of the fluorescent azide and that of ascorbic acid in the staining reaction (data not shown). In the case of ascorbic acid, for a fixed concentration of Cu(II) of 1 mM (in the form of CuSO4), the intensity of the EdU stain increased as the ascorbic acid concentration was increased to 50–100 mM.

The staining reaction between cellular EdU-labeled DNA and fluorescent azides proceeds very quickly, being half-maximal in <5 min under the staining conditions we used (see below). This fast kinetics might be because EdU-labeled DNA is a multivalent, polymeric click chemistry substrate. The triazoles formed from the reaction between the ethynyl group and the fluorescent azide are Cu(I) chelators, increasing the local concentration of the catalyst and accelerating the reaction of neighboring ethynyl groups. This effect has been described for other multivalent [3 + 2] cycloaddition substrates (10).

EdU detection proceeds smoothly with a variety of fluorescent azides we synthesized, including aliphatic azides (compounds 2 and 3 in Fig. 1) and aromatic ones (compound 4 in Fig. 1, which can be easily synthesized in a single step in large amounts as required for some whole-mount staining procedures). The EdU detection method is also compatible with immunostaining. We recommend performing a regular immunostaining protocol after first performing the EdU stain (see below).

We find that under the conditions used (1 mM CuSO4, 100 mM ascorbic acid, and 10 μM fluorescent azide), the staining reaction does not proceed to completion and only a fraction of the ethynyl groups present on DNA is reacted before the staining mixture loses activity. As shown in Fig. 3 A, if EdU-labeled cells first stained with Alexa488-azide (green) are subsequently reacted with fresh staining mixture containing Alexa594-azide (red), the DNA is strongly stained both green and red. The two staining patterns display perfect colocalization (see Fig. 3 A Right, showing an overlay of the two successive EdU stains), demonstrating the high reproducibility of the EdU detection method. The intensity of the EdU stain can thus be increased through repeated incubation with fresh detection mixture, without a change in the staining pattern.

Reproducibility of EdU labeling (A) and comparison with BrdU (B). (A) NIH 3T3 cells labeled by incubation overnight with 2 μM EdU were fixed and reacted successively with 10 μM Alexa488-azide and 10 μM Alexa594-azide, respectively, as described in Materiales y métodos. The cells were imaged by fluorescence microscopy. (Izquierda) Alexa488-azide stain. (Center) Alexa594-azide stain. (Derecha) Overlay of the Alexa488 and Alexa594 images. The complete colocalization of the two colors indicates that the two successive azide stains detect ethynyl groups that have the same distribution within the cell nucleus. (B) NIH 3T3 cells labeled by incubation overnight with 2 μM EdU and 2 μM BrdU were fixed and reacted with 10 μM Alexa594-azide, followed by standard BrdU immunodetection by using an anti-BrdU monoclonal antibody and an Alexa488-conjugated secondary antibody. (Izquierda) BrdU stain. (Center) EdU stain. (Derecha) Overlay of the BrdU and EdU images. Note that each cell that incorporated BrdU also incorporated EdU. The BrdU micrograph was taken by using a five-times longer exposure than the exposure used for EdU (500 ms compared with 100 ms) under identical digital camera settings.

We next asked how EdU compares with the conventional BrdU-labeling method. Cultured NIH 3T3 cells were labeled with both EdU and BrdU by overnight incubation in media containing 2 μM each of the two deoxynucleoside analogues. The cells were then fixed, stained with Alexa594-azid,e and then processed for BrdU immunofluorescent detection. As shown in Fig. 3 B, all cells staining with BrdU also show EdU staining. In addition, the EdU staining is significantly more intense than the BrdU staining.

Detection of EdU Without Fixation.

The Alexa568-azide used earlier is not cell-permeable and required cell fixation and permeabilization to stain EdU-labeled cells. To detect EdU-labeled DNA under native conditions (i.e., without fixation and permeabilization) we developed a cell-permeable tetramethylrhodamine (TMR) azide (Fig. 1). After confirming that TMR-azide can enter live cells, we used it to stain live cells that had been labeled with EdU. The staining mixture containing TMR-azide was added to cells on a fluorescent microscope stage at time t = 0, to initiate the staining reaction, which was then followed by fluorescence confocal microscopy. As shown in Fig. 2, TMR-azide reacts rapidly with EdU-labeled DNA in cells, in the presence of Cu(I) generated en el lugar from Cu(II) and ascorbic acid, suggesting that the click reaction takes place efficiently on native cellular DNA. The staining reaction is half-maximal in <5 min. This experiment underestimates the staining rate, because we used only 500 nM TMR-azide in the detection reaction (as opposed to the usual 10–50 μM azide concentration we normally use for staining). The lower TMR-azide concentration used in this experiment was required to allow imaging of cellular DNA by fluorescence microscopy, against the background of unreacted TMR-azide in the staining solution.

It should be noted that Cu(I) is toxic to cells and that Cu(I)-catalyzed click reaction conditions result in cell death. We believe, however, that even if the staining conditions were nontoxic, live cell microscopy of EdU-labeled and azide-stained cells would be of limited utility. The reaction between ethynyl groups on DNA and fluorescent azide molecules results in covalent attachment of many large chemical groups to cellular DNA. If cells were to survive staining, such a chemical insult would likely trigger a massive DNA damage response and subsequent cytotoxicity. Despite Cu(I) toxicity, we envision that the ability to stain EdU-labeled cells rapidly and without fixation will be useful in a number of situations: (I) when permeabilization and fixation degrade the structure of the specimen (ii) for assaying DNA synthesis at the end of live cell experiments, without removing the cells from the microscope stage (iii) in high-throughput screening assays, when reducing the number of steps in the staining protocols is important. Additionally, staining cells without fixation and permeabilization can prevent cell detachment and loss from coverslips.

Use of EdU to Assay DNA Synthesis in Animals.

We next wanted to determine whether EdU can be used to detect DNA synthesis in animals. One hundred micrograms of EdU in PBS were injected i.p. into adult mice and tissues were harvested and fixed 96 h after injection. Paraffin sections were stained with Alexa568 azide for 15 min, washed, and then imaged by fluorescence microscopy. Because of the high intensity of fluorescence, large sections can be quickly scanned by using low-magnification objectives, even a simple dissecting microscope equipped with fluorescence. As shown in Fig. 4, EdU strongly labels proliferating cells en vivo (Fig. 4 A y B, showing sections of small intestine). It is well suited for detecting very low levels of cell proliferation in tissues that undergo very little to no cellular turnover (Fig. 4 C y D, showing sections of mouse brain).

Labeling DNA en vivo by using EdU. An adult mouse was injected i.p. with 100 μg of EdU in PBS. Tissues were harvested, fixed, and sectioned 96 h later. Tissue sections on slides were then reacted for 10 min with 10 μM Alexa568-azide. The images shown are overlays of a DIC image of the sectioned tissue, a fluorescent image of cellular DNA (Hoechst stain blue), and a fluorescent image of EdU-labeled DNA revealed by reaction with Alexa568 azide (red). (A y B) Mouse small intestine. Villi are seen in transverse section in A and in longitudinal section in B. The cells with red nuclei are descended from cells that had been in S phase during the EdU pulse and thus incorporated EdU into their DNA. (C y D) Mouse brain. The vast majority of nuclei on brain sections were not labeled with EdU, confirming that the label does not detectably incorporate into the DNA of nondividing cells. Each of the two images shows a field of cells containing an EdU-labeled nucleus, belonging to a cell of undetermined type.

Finally, we wanted to determine whether EdU can be used to detect cell proliferation in large, fresh tissue and organ explants. Mice were injected i.p. with 100 μgrams EdU and their small intestine was harvested 24 or 96 h later. The fresh intestine was then directly stained with the cell-permeable TMR-azide, followed by fixation and washing to remove unincorporated TMR-azide. As shown in Fig. 5, after 24 h, EdU staining can be detected strongly in cells present at the base of the villi, which is the location described for the actively dividing cells of the small intestine mucosa. Ninety-six hours after the EdU pulse, the labeled cells have multiplied and migrated distally, away from the base of the villi and toward their tips. This whole-mount imaging of cellular turnover in small intestine villi is consistent with classical measurements and demonstrates that EdU can be used to assay cells proliferation in fresh tissues rapidly and with high sensitivity. In this context, EdU allows the rapid and sensitive staining of large organ fragments in whole mounts this will make the study of organ and tissue dynamics much easier than by earlier methods.

Exploring cell proliferation and tissue dynamics in animals using EdU. Whole-mount fluorescent images of mouse small intestine, stained to detect EdU incorporation. Two adult mice were each injected i.p. with 100 μg of EdU in PBS and their small intestines were removed after 24 and 96 h, respectively. A freshly harvested 2-cm-long segment of the small intestine (A) was opened with a longitudinal cut, rinsed, and immediately stained for 10 min with 100 μM TMR-azide in the presence of Cu(I), without fixation or permeabilization. The intestine piece was then fixed, washed to remove unreacted TMR-azide, and imaged at low magnification on a dissecting microscope equipped with fluorescence. (B y C) After 24 h, the EdU shows strong incorporation in cells located at the base of each villus. (D and E) Ninety-six hours after the EdU pulse, the labeled cells have moved away from the base, near the tips of the villi. See text and Materiales y métodos for details.

In some experiments it would be desirable to perform two different DNA-labeling pulses and be able to distinguish between the two. We reasoned that the alkyne and azide functionalities can be swapped between the deoxynucleoside analogue and detection reagent to allow two-color DNA staining based on click chemistry. We synthesized 5-azido-3′-deoxyuridine (AdU) as described for 5-azido-dUTP (11). Like EdU, this analogue was incorporated into cellular DNA. We detected it by reacting with a terminal alkyne conjugated to the Alexa568 fluorophore, under staining conditions identical to those used for EdU (see Materiales y métodos). Although we were able to detect AdU-labeled DNA in cells by fluorescence microscopy, the background was, for unknown reasons, much higher than in the case of EdU (data not shown), as reported for other instances in which click reactions were performed on cells metabolically labeled with azides (12). The routine use of AdU as a second color for DNA labeling will have to await the development of a detection protocol that affords lower background staining. The combination of BrdU and EdU (Fig. 3 B), meanwhile, offers a simple and robust way to perform double-DNA labeling.

We envision that the superior structural preservation allowed by EdU relative to BrdU staining should facilitate high-resolution electron microscopy studies of cellular chromatin. For example, EdU-labeled DNA can be imaged by electron microscopy by using an azide conjugated to eosin (or another fluorophore that generates singlet oxygen efficiently), followed by photoconversion of diaminobenzidine into an osmiophilic precipitate (13). Immunoelectron microscopy of EdU-labeled chromatin under nondenaturing conditions can also be achieved by using an azide conjugated to a good epitope (such as digoxigenin) followed by immunostaining.

A recent method called photoactivation localization microscopy (PALM) (14) generates nanometer-resolution images of biological molecules in cells by repeated cycles of photoactivation of “caged” fluorophores followed by imaging until fluorophore bleaching. The amount of fluorescent signal generated during EdU detection can be easily controlled (by varying ascorbic acid and fluorescent azide concentrations, and by the ability to perform successive stains), in a manner similar to photoactivation of fluorescence used for the PALM technique. The EdU-labeling method is thus well suited for optical imaging of cellular DNA at nanometer resolution.


Biophysical Target Engagement Assays in Chemical Biology and Pharmacological Research

Biophysical methods for the detection and quantification of binding between small molecules or biologicals and their target are fundamental to chemical biology and pharmacological research. Target engagement assays can be utilized for target deconvolution and validation, establishing structure-activity relationships, probe discovery, and understanding the mode of action of prospective therapeutics.

Different biophysical methods such as isothermal titration calorimetry, differential scanning fluorimetry, surface plasmon resonance, biolayer interferometry and microscale thermophoresis have been established to measure target-ligand interactions using purified target molecules. Despite their various advantages each method also has different limitations, including high material consumption, sensitivity limits, low throughput or impacted performance when working with complex matrices or crude material. Moreover, the binding observed between a ligand and a target in a cell-free system does not always translate to a similar interaction within the intracellular environment. Therefore, new techniques have emerged in recent years to quantify the binding of small molecules and biologicals to targets within living cells.

The goal of the current Research Topic is to introduce novel approaches to monitor and measure target engagement, and present new technological and methodological advances to break through the limitations of established methods in cell free and living systems.

The scope of this Research Topic is to cover the application of well established, recent, and novel biophysical target engagement technologies in chemical biology and pharmacological research. We welcome all available article types, including original research articles, brief research reports, and reviews covering, but not limited to:
• Target engagement in cells
• Cell free assays
• Target deconvolution
• Mode of action studies
• Labelled chemical probes

Palabras clave: molecular interaction, target engagement, structure-activity relationship, mode of action, binding kinetics, cellular assay

Important Note: All contributions to this Research Topic must be within the scope of the section and journal to which they are submitted, as defined in their mission statements. Frontiers reserves the right to guide an out-of-scope manuscript to a more suitable section or journal at any stage of peer review.

Biophysical methods for the detection and quantification of binding between small molecules or biologicals and their target are fundamental to chemical biology and pharmacological research. Target engagement assays can be utilized for target deconvolution and validation, establishing structure-activity relationships, probe discovery, and understanding the mode of action of prospective therapeutics.

Different biophysical methods such as isothermal titration calorimetry, differential scanning fluorimetry, surface plasmon resonance, biolayer interferometry and microscale thermophoresis have been established to measure target-ligand interactions using purified target molecules. Despite their various advantages each method also has different limitations, including high material consumption, sensitivity limits, low throughput or impacted performance when working with complex matrices or crude material. Moreover, the binding observed between a ligand and a target in a cell-free system does not always translate to a similar interaction within the intracellular environment. Therefore, new techniques have emerged in recent years to quantify the binding of small molecules and biologicals to targets within living cells.

The goal of the current Research Topic is to introduce novel approaches to monitor and measure target engagement, and present new technological and methodological advances to break through the limitations of established methods in cell free and living systems.

The scope of this Research Topic is to cover the application of well established, recent, and novel biophysical target engagement technologies in chemical biology and pharmacological research. We welcome all available article types, including original research articles, brief research reports, and reviews covering, but not limited to:
• Target engagement in cells
• Cell free assays
• Target deconvolution
• Mode of action studies
• Labelled chemical probes

Palabras clave: molecular interaction, target engagement, structure-activity relationship, mode of action, binding kinetics, cellular assay

Important Note: All contributions to this Research Topic must be within the scope of the section and journal to which they are submitted, as defined in their mission statements. Frontiers reserves the right to guide an out-of-scope manuscript to a more suitable section or journal at any stage of peer review.


Contenido

Immunocytochemistry differs from immunohistochemistry [2] in that the former is performed on samples of intact cells that have had most, if not all, of their surrounding extracellular matrix removed. [ cita necesaria ] This includes individual cells that have been isolated from a block of solid tissue, cells grown within a culture, cells deposited from suspension, or cells taken from a smear. In contrast, immunohistochemical samples are sections of biological tissue, where each cell is surrounded by tissue architecture and other cells normally found in the intact tissue. Immunocytochemistry is a technique used to assess the presence of a specific protein or antigen in cells (cultured cells, cell suspensions) by use of a specific antibody, which binds to it, thereby allowing visualization and examination under a microscope. It is a valuable tool for the determination of cellular contents from individual cells. Samples that can be analyzed include blood smears, aspirates, swabs, cultured cells, and cell suspensions.

There are many ways to prepare cell samples for immunocytochemical analysis. Each method has its own strengths and unique characteristics so the right method can be chosen for the desired sample and outcome.

Cells to be stained can be attached to a solid support to allow easy handling in subsequent procedures. This can be achieved by several methods: adherent cells may be grown on microscope slides, coverslips, or an optically suitable plastic support. Suspension cells can be centrifuged onto glass slides (cytospin), bound to solid support using chemical linkers, or in some cases handled in suspension.

Concentrated cellular suspensions that exist in a low-viscosity medium make good candidates for smear preparations. Dilute cell suspensions existing in a dilute medium are best suited for the preparation of cytospins through cytocentrifugation. Cell suspensions that exist in a high-viscosity medium, are best suited to be tested as swab preparations. The constant among these preparations is that the whole cell is present on the slide surface. For any intercellular reaction to take place, immunoglobulin must first traverse the cell membrane that is intact in these preparations. Reactions taking place in the nucleus can be more difficult, and the extracellular fluids can create unique obstacles in the performance of immunocytochemistry. In this situation, permeabilizing cells using detergent (Triton X-100 or Tween-20) or choosing organic fixatives (acetone, methanol, or ethanol) becomes necessary.

Antibodies are an important tool for demonstrating both the presence and the subcellular localization of an antigen. Cell staining is a very versatile technique and, if the antigen is highly localized, can detect as few as a thousand antigen molecules in a cell. In some circumstances, cell staining may also be used to determine the approximate concentration of an antigen, especially by an image analyzer.

There are many methods to obtain immunological detection on tissues, including those tied directly to primary antibodies or antisera. A direct method involves the use of a detectable tag (e.g., fluorescent molecule, gold particles, etc., ) directly to the antibody [3] that is then allowed to bind to the antigen (e.g., protein) in a cell.

Alternatively, there are many indirect methods. In one such method, the antigen is bound by a primary antibody which is then amplified by use of a secondary antibody which binds to the primary antibody. Next, a tertiary reagent containing an enzymatic moiety is applied and binds to the secondary antibody. When the quaternary reagent, or substrate, is applied, the enzymatic end of the tertiary reagent converts the substrate into a pigment reaction product, which produces a color (many colors are possible brown, black, red, etc.,) in the same location that the original primary antibody recognized that antigen of interest.

Some examples of sustratos used (also known as chromogens) are AEC (3-Amino-9-EthylCarbazole), or DAB (3,3'-Diaminobenzidine). Use of one of these reagents after exposure to the necessary enzyme (e.g., horseradish peroxidase conjugated to an antibody reagent) produces a positive immunoreaction product. Immunocytochemical visualization of specific antigens of interest can be used when a less specific stain like H&E (Hematoxylin and Eosin) cannot be used for a diagnosis to be made or to provide additional predictive information regarding treatment (in some cancers, for example).

Alternatively the secondary antibody may be covalently linked to a fluorophore (FITC and Rhodamine are the most common) which is detected in a fluorescence or confocal microscope. The location of fluorescence will vary according to the target molecule, external for membrane proteins, and internal for cytoplasmic proteins. In this way immunofluorescence is a powerful technique when combined with confocal microscopy for studying the location of proteins and dynamic processes (exocytosis, endocytosis, etc.).


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Methods in Enzymology. C. ed. Academic Press Inc., 2010. p. 179-195 (Methods in Enzymology Vol. 484, No. C).

Research output : Chapter in Book/Report/Conference proceeding › Chapter

T1 - Methods to detect cell surface expression and constitutive activity of GPR6

N2 - GPR6 is a constitutively active Gs-coupled receptor that can signal from intracellular compartments. We present different methods used to study cell surface expression of receptors and other membrane proteins. A comparison of these methods shows that methods based on susceptibility to proteolytic enzymes are more efficient at providing estimates of cell surface expression than the commonly used cell surface biotinylation method. We also present different methods that can be used to detect constitutive activity of Gs-coupled receptors. Imaging-based assays to detect intracellular cyclic AMP accumulation are well suited to study signaling at a single cell level. These assays are particularly useful when the cells of interest form a small fraction of the culture such as primary cultures with low transfection efficiency.

AB - GPR6 is a constitutively active Gs-coupled receptor that can signal from intracellular compartments. We present different methods used to study cell surface expression of receptors and other membrane proteins. A comparison of these methods shows that methods based on susceptibility to proteolytic enzymes are more efficient at providing estimates of cell surface expression than the commonly used cell surface biotinylation method. We also present different methods that can be used to detect constitutive activity of Gs-coupled receptors. Imaging-based assays to detect intracellular cyclic AMP accumulation are well suited to study signaling at a single cell level. These assays are particularly useful when the cells of interest form a small fraction of the culture such as primary cultures with low transfection efficiency.


Resumen de la sección

Each step of the cell cycle is monitored by internal controls called checkpoints. There are three major checkpoints in the cell cycle: one near the end of G1, a second at the G2/M transition, and the third during metaphase. Positive regulator molecules allow the cell cycle to advance to the next stage. Negative regulator molecules monitor cellular conditions and can halt the cycle until specific requirements are met.

Additional Self Check Questions

1. Rb and other proteins that negatively regulate the cell cycle are sometimes called tumor suppressors. Why do you think the name tumor suppressor might be an appropriate for these proteins?

2. Describe the general conditions that must be met at each of the three main cell cycle checkpoints.

3. Explain the roles of the positive cell cycle regulators compared to the negative regulators.

4. What steps are necessary for Cdk to become fully active?

5. Rb is a negative regulator that blocks the cell cycle at the G1 checkpoint until the cell achieves a requisite size. What molecular mechanism does Rb employ to halt the cell cycle?

Respuestas

1. Rb and other negative regulatory proteins control cell division and therefore prevent the formation of tumors. Mutations that prevent these proteins from carrying out their function can result in cancer.

2. The G1 checkpoint monitors adequate cell growth, the state of the genomic DNA, adequate stores of energy, and materials for S phase. At the G2 checkpoint, DNA is checked to ensure that all chromosomes were duplicated and that there are no mistakes in newly synthesized DNA. Additionally, cell size and energy reserves are evaluated. The M checkpoint confirms the correct attachment of the mitotic spindle fibers to the kinetochores.

3. Positive cell regulators such as cyclin and Cdk perform tasks that advance the cell cycle to the next stage. Negative regulators such as Rb, p53, and p21 block the progression of the cell cycle until certain events have occurred.

4. Cdk must bind to a cyclin, and it must be phosphorylated in the correct position to become fully active.

5. Rb is active when it is dephosphorylated. In this state, Rb binds to E2F, which is a transcription factor required for the transcription and eventual translation of molecules required for the G1/S transition. E2F cannot transcribe certain genes when it is bound to Rb. As the cell increases in size, Rb becomes phosphorylated, inactivated, and releases E2F. E2F can then promote the transcription of the genes it controls, and the transition proteins will be produced.

Glosario

cell cycle checkpoint: mechanism that monitors the preparedness of a eukaryotic cell to advance through the various cell cycle stages

cyclin: one of a group of proteins that act in conjunction with cyclin-dependent kinases to help regulate the cell cycle by phosphorylating key proteins the concentrations of cyclins fluctuate throughout the cell cycle

cyclin-dependent kinase: one of a group of protein kinases that helps to regulate the cell cycle when bound to cyclin it functions to phosphorylate other proteins that are either activated or inactivated by phosphorylation

p21: cell cycle regulatory protein that inhibits the cell cycle its levels are controlled by p53

p53: cell cycle regulatory protein that regulates cell growth and monitors DNA damage it halts the progression of the cell cycle in cases of DNA damage and may induce apoptosis

retinoblastoma protein (Rb): regulatory molecule that exhibits negative effects on the cell cycle by interacting with a transcription factor (E2F)


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