Información

¿En qué se diferencia la especificidad para unirse al anticuerpo entre el antígeno "caliente" y el "frío" en el radioinmunoensayo?

¿En qué se diferencia la especificidad para unirse al anticuerpo entre el antígeno



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Esta pregunta está relacionada con el radioinmunoensayo. En este ensayo, el antígeno "frío" reemplaza al antígeno "caliente". ¿Por qué es así, si ambos antígenos son iguales y, por tanto, su especificidad? ¿La molécula radiactiva cambia su especificidad?


La especificidad es la misma, pero la unión proteína-ligando es un proceso de equilibrio. En otras palabras, el antígeno se asocia y se disocia constantemente del anticuerpo. A medida que se disocia un antígeno caliente, es posible que un antígeno frío pueda ocupar su lugar y viceversa. A medida que aumenta la proporción de antígenos fríos y calientes, existe una mayor probabilidad de que los antígenos fríos ocupen el lugar de los antígenos calientes.

Puedes leer más en Wikipedia.


Especificidad de los anticuerpos y receptores de linfocitos T biespecíficos que se dirigen al péptido-HLA

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Holland, C. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Pentier, J. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de de Wet, B. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Srikannathasan, V. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Blicher, T. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Pengelly, R. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Spinner, T. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Cameron, B. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Jeyanthan, A. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Aleksic, M. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Robinson, R. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Harper, S. en: JCI | PubMed | Académico de Google | />

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Lepore, M. en: JCI | PubMed | Académico de Google | />

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de van der Kamp, M. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Rizkallah, P. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Jakobsen, B. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Encuentre artículos de Vuidepot, A. en: JCI | PubMed | Google Académico

1 Immunocore Ltd., Milton Park, Abingdon, Reino Unido.

2 Departamento de Biología y Bioquímica y

3 Centro de formación de doctorado en tecnologías químicas sostenibles, Universidad de Bath, Bath, Reino Unido.

4 Escuela de Bioquímica, Universidad de Bristol, Bristol, Reino Unido.

5 Facultad de Medicina de la Universidad de Cardiff, Heath Park, Cardiff, Reino Unido.

Envíe la correspondencia a: David Cole y Annelise Vuidepot, 91 Park Drive, Milton Park, Abingdon, Oxfordshire, OX14 4RY, Reino Unido. Teléfono: 44.1235.776256, 44.1235.438668 Correo electrónico: [email protected], [email protected]

Nota de autoría: CJH, RMC, JMP, BDW y AL contribuyeron igualmente a este estudio.

Los complejos de péptido asociado a tumor-antígeno leucocitario humano (pHLA) representan el grupo más grande de epítopos específicos de cáncer expresados ​​en la superficie celular, lo que los convierte en objetivos atractivos para las terapias contra el cáncer. Se están desarrollando moléculas biespecíficas solubles que incorporan una función efectora anti-CD3 para redirigir las células T contra estos objetivos utilizando 2 enfoques diferentes. El primero logra el reconocimiento de pHLA a través de versiones mejoradas por afinidad de TCR naturales (por ejemplo, receptores de células T monoclonales inmuno-movilizadores contra moléculas de cáncer [ImmTAC]), mientras que el segundo aprovecha un formato basado en anticuerpos (anticuerpos imitadores de TCR). Para ambas clases de reactivos, la especificidad del objetivo es vital, considerando el vasto universo de moléculas potenciales de pHLA que se pueden presentar en células sanas. Aquí, hicimos uso de enfoques estructurales, bioquímicos y computacionales para investigar las reglas moleculares que sustentan los patrones de reactividad de los biespecíficos dirigidos a pHLA. Demostramos que los TCR mejorados por afinidad se involucran con pHLA utilizando una huella energética comparativamente amplia y equilibrada, con interacciones distribuidas en varias cadenas laterales de péptidos y HLA. Como moléculas ImmTAC, estos TCR también retuvieron un mayor grado de selectividad de pHLA, con menos actividad fuera del objetivo en los ensayos celulares. Por el contrario, los anticuerpos imitadores de TCR tendieron a exhibir modos de unión enfocados más hacia puntos calientes en la superficie de HLA y exhibieron un mayor grado de reactividad cruzada. Nuestros hallazgos amplían nuestra comprensión de los principios básicos que sustentan la selectividad de pHLA y ejemplifican una serie de enfoques moleculares que se pueden utilizar para probar la especificidad de las moléculas dirigidas a pHLA, lo que ayuda al desarrollo de futuros reactivos.

La capacidad de dirigirse selectivamente a antígenos específicos de tumores es muy prometedora para el desarrollo de tratamientos específicos contra el cáncer, pero su identificación sigue siendo un desafío clave. Los fragmentos de péptidos presentados en la superficie celular por los antígenos leucocitarios humanos (pHLA) representan el proteoma intracelular, y debido a que este también incluye proteínas desreguladas y específicas del cáncer (1, 2), los pHLA constituyen una fuente importante de antígenos específicos de tumores. Sin embargo, apuntar a estas moléculas es difícil por dos razones. Primero, sus niveles de presentación natural pueden ser muy bajos (a menudo por debajo de 10 copias de cada epítopo peptídico específico por célula) (3) y segundo, los péptidos se reconocen en el contexto de HLA, una molécula expresada por la mayoría de las células (es decir, la selectividad del péptido podría perderse si las interacciones HLA dominan la interfaz de unión) (4, 5).

El sistema inmunológico supera naturalmente estos obstáculos a través del reconocimiento selectivo de pHLA por parte del receptor de células T (TCR), lo que permite que las células T se activen hacia antígenos de bajo nivel (6 - 8). Aunque los mecanismos que determinan la selectividad de péptidos por los TCR naturales no se comprenden completamente, es probable que el modo de unión empleado por el TCR sea fundamentalmente importante, como lo demuestra el modo de unión conservado observado para prácticamente todas las estructuras de TCR-pHLA resueltas hasta la fecha (9). . Esta interacción canónica coloca el TCR en diagonal a través del surco de unión a HLA, colocando los bucles de la región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de TCR reorganizados somáticamente en el centro sobre el determinante antigénico (péptido) con los bucles CDR1 / 2 codificados en la línea germinal colocados principalmente sobre las hélices HLA , permitiendo que los TCR naturales detecten pHLA de una manera dependiente de péptidos. A pesar de la necesidad de una selectividad peptídica precisa, un número limitado de TCR aún debe mantener la capacidad de reconocer millones de antígenos diana potenciales (10, 11). En consecuencia, se ha demostrado que los TCR reaccionan de forma cruzada con una amplia gama de péptidos diferentes (11 - 14), pero se seleccionan en el timo para evitar que las especificidades se superpongan con abundantes autoepítopos para mantener la autotolerancia. Aunque los mecanismos que sustentan estas características aún no se han determinado, la afinidad de unión relativamente débil de los TCR seleccionados tímicamente (KDs en el rango de afinidad micromolar refs. 15, 16) ha demostrado ser importante para la sensibilidad de las células T (17) y es probable que también sea importante para mantener la auto-tolerancia.

La débil afinidad de los TCR seleccionados naturalmente, combinada con las dificultades para fabricar una proteína unida a la membrana como reactivo soluble, impone ciertos desafíos a su uso para aplicaciones terapéuticas. En consecuencia, las terapias basadas en células T más ampliamente utilizadas implican la transferencia adoptiva de células T específicas de antígeno expandidas o células T modificadas genéticamente para expresar un TCR específico de antígeno artificial (receptor específico de afinidad de péptidos mejorada [SPEAR]) (18) o anticuerpo (receptor de antígeno quimérico [CAR]) (19). Aunque prometedoras, estas terapias se complican por la necesidad de preparar células T terapéuticas paciente por paciente y la incapacidad de controlar la dosificación en respuesta a posibles toxicidades (20).

Los redirectores de células T biespecíficas solubles, que consisten en el reconocimiento de antígenos y los dominios que se acoplan a las células T, eluden muchas de las limitaciones del enfoque de transferencia adoptiva (21). El reconocimiento de antígenos de los reactivos dirigidos a pHLA puede realizarse mediante un TCR o un dominio de anticuerpo. Los receptores de células T monoclonales inmuno-movilizantes contra el cáncer (ImmTAC) son moléculas biespecíficas con un TCR soluble diseñado fusionado a una función efectora anti-CD3 (22), por lo que estas moléculas redirigen a las células T específicamente hacia las células que presentan un pHLA diana (22). El componente TCR de las moléculas ImmTAC se estabiliza con un enlace disulfuro entre cadenas (23) y se mejora la afinidad mediante la presentación de fagos para generar reactivos de TCR solubles y altamente estables que pueden unirse a pHLA con afinidades picomolares bajas y con semividas de unión de varias horas ( en comparación con las vidas medias de segundos para los TCR solubles en WT) (22, 24). Estos atributos permiten que las moléculas ImmTAC provoquen respuestas antitumorales a concentraciones picomolares contra células que expresan niveles muy bajos de pHLA en la superficie celular. En comparación, los activadores de células T biespecíficas (BiTE) pueden utilizar anticuerpos para atacar pHLA (anticuerpos imitadores de TCR) como moléculas biespecíficas solubles que encajan con las células T (25 - 38). Los anticuerpos, a diferencia de los TCR que están anclados en la membrana celular, pueden existir naturalmente como moléculas efectoras solubles (y como tales, son más fáciles de diseñar como reactivos solubles) y, por lo general, tienen una fuerte afinidad por su antígeno (rango nanomolar), lo que los hace atractivos para desarrollo como terapéutica soluble (21). El principal desafío para una terapia de pHLA dirigida es lograr suficiente especificidad en el contexto de un vasto panorama de autoantígenos potenciales. Por ejemplo, incluso en tipos de células individuales, los datos de nuestra base de datos de espectrometría de masas interna y la evidencia directa publicada demuestran que la cantidad de péptidos únicos puede estar en el rango de decenas de miles (39 - 42). Teniendo en cuenta el genoma completo que codifica la proteína humana, se ha estimado que el número de péptidos presentados supera los 11 millones (43).

En este estudio, utilizamos una combinación de enfoques estructurales, moleculares y computacionales para comprender los mecanismos moleculares que sustentan la selectividad de pHLA y, en consecuencia, la posible reactividad cruzada de los redirectores de células T biespecíficas solubles. Demostramos que la utilización de un modo de unión de tipo TCR nativo no era predictiva de la selectividad del péptido. De hecho, la selectividad de péptidos, definida por niveles más bajos de reactividad cruzada de pHLA y menos actividad fuera del objetivo en las pruebas celulares, se asoció con una firma energética caracterizada por amplias interacciones con varias cadenas laterales de péptidos, así como con la estructura del péptido. Estos hallazgos tienen implicaciones importantes para las reglas subyacentes que determinan la discriminación de pHLA e identifican consideraciones clave en el diseño de inmunoterapéuticos que se dirigen a estas proteínas de la superficie celular.

Análisis estructural de reactivos dirigidos a pHLA. Seleccionamos anticuerpos imitadores de TCR de acuerdo con pruebas in vitro e in vivo y en función de la disponibilidad de estructuras de complejos cristalinos para permitir el análisis molecular (Tabla complementaria 1 material complementario disponible en línea con este artículo https://doi.org/10.1172/JCI130562DS1) . Se han informado varios imitadores de TCR adicionales, sin embargo, la mayoría carecía de suficiente información publicada para su inclusión (secuencia, estructura y datos de especificidad). Como el antígeno peptídico puede tener una influencia importante en la especificidad (es decir, algunos péptidos pueden tener una homología cercana con los auto-péptidos), elegimos TCR con afinidad mejorada en función de su reconocimiento de determinantes de pHLA idénticos o estrechamente relacionados en comparación con los imitadores de TCR. . Aquí, evaluamos reactivos diseñados para reconocer el NY-ESO-1157–165 péptido SLLMWITQC derivado del antígeno del cáncer de testículo, presentado por HLA-A * 02: 01 (A2-SLL), el MAGE-A1161–169/ MAGE3-A3168–176 péptidos derivados de antígenos asociados al melanoma EADPTGHSY (A1-EAD) y EVDPIGHLY (A1-EVD), presentados por HLA-A * 01: 01, y WT126–134 Péptido RMFPNAPYL derivado del antígeno del tumor de Wilms, presentado por HLA-A * 02: 01 (A2-RMF). Aunque no es una comparación directa, A1-EAD y A1-EVD todavía representaban un sistema útil para incluir debido a los patrones de expresión tumoral similares de ambas proteínas, la misma restricción de HLA y secuencias de péptidos similares, una consecuencia de ambos péptidos que representan la misma región de las proteínas MAGE altamente relacionadas.

Además de las estructuras cristalinas previamente publicadas para anticuerpos imitadores de TCR y TCR mejorados por afinidad en el complejo con A2-SLL (36, 44, 45), A2-RMF (25) y A1-EVD / A1-EAD (refs. 46, 47 y Figura 1A), resolvimos la estructura del WT1_α con afinidad mejorada7β2 TCR en complejo con A2-RMF a 2,8 Å para completar el conjunto (Tabla 1). Juntos, estos datos se analizaron para identificar cualquier característica estructural que pudiera influir en la selectividad del péptido de cada reactivo. Comparamos el rango normal de unión (ángulo de cruce y zona de compromiso) de los TCR naturales (9) con los TCR mejorados por afinidad y los anticuerpos imitadores de TCR. Los TCR mejorados por afinidad (1G4_α58β61 TCR, MAG-IC3 TCR y WT1_α7β2 TCR) unido dentro del rango normal de topologías de TCR naturales, con los bucles CDR3 de ambas cadenas enfocados sobre la protuberancia del péptido central (aminoácidos 4-6) (Figura 1B). Este modo de unión permitió que los TCR mejorados por afinidad formaran contactos con 5 de los 9 aminoácidos en el péptido y múltiples interacciones con el α1 y α2 dominios del HLA (Tabla 2). El 1G4_α58β61 y WT1_α7β2 Los TCR se centraron más en péptidos que los TCR MAG-IC3 en términos de porcentajes (57%, 36% y 14%, respectivamente) y números (115, 64 y 16, respectivamente) de enlaces peptídicos. El 1G4_α58β61 y WT1_α7β2 Los TCR también exhibieron áreas de superficie enterrada (BSA) más grandes que MAG-IC3, pero todos estaban dentro o cerca del rango normal (1240–2400 Å 2) (9). El anticuerpo imitador de TCR 3M4E5 se unió de una manera muy similar a la de los TCR naturales, haciendo contactos con 5 residuos de péptidos, 38% de contactos de péptidos y una BSA de 2502 Å 2. Sin embargo, el análisis estructural reveló un enfoque de interacciones en el residuo peptídico W5, donde se concentraron la mitad de los contactos peptídicos (24/51). Aunque el 1G4_α58β61 El TCR también hizo muchos contactos con la gran cadena lateral expuesta de W5 (54/115), la unión se centró menos en este residuo y se hicieron contactos importantes adicionales con otros residuos de péptidos, particularmente M4 (31/115) y Q8 (15/115 ). Se han detectado puntos calientes de unión a péptidos para los TCR naturales (12, 48, 49) sin embargo, esta característica estructural se ha asociado con los TCR autorreactivos y puede correlacionarse con un alto nivel de reactividad cruzada de TCR (14, 49). Por el contrario, los anticuerpos que imitan a Hyb3.3 y ESK-1 se unen a sus respectivos pHLA mediante una topología no convencional. La unión de Hyb3.3 se desplazó en el extremo C con un ángulo de cruce sustancialmente fuera del intervalo natural de TCR-pHLA. A pesar de esta topología inusual, Hyb3.3 retuvo amplios contactos peptídicos en 6 de los 9 aminoácidos, lo que generó un 25% de contactos peptídicos y una BSA de 2024 Å 2 (Tabla 2). La unión de ESK-1 se desplazó N-terminalmente con un ángulo de cruce no convencional. Este modo de unión colocó el anticuerpo imitador de TCR de modo que los bucles de CDR3 se enfocaron sobre el α2 hélice del HLA, lo que resulta en una interacción muy limitada con el péptido. Este modo de unión dio como resultado que ESK-1 hiciera solo un 10% de contactos peptídicos, y la mayoría de estos se formaron con el residuo peptídico 1. Este modo de unión centrado en HLA, donde solo se estableció contacto con 1 residuo peptídico, planteó preguntas sobre la capacidad de la ESK -1 imitador de TCR para conservar la especificidad. Sin embargo, para todos los demás reactivos dirigidos a HLA considerados aquí, sus estructuras parecían conservar muchas de las características observadas para las interacciones naturales TCR-pHLA.

Análisis estructural de reactivos dirigidos a pHLA. Se analizaron las estructuras de los TCR y los imitadores de TCR, en complejo con pHLA, para determinar el mecanismo estructural que sustenta sus características de unión. (A) TCR (cinta azul) o imitaciones de TCR (cinta naranja) que se unen al péptido (barras rojas) y HLA (cinta verde) en comparación con el rango de unión empleado por todas las estructuras WT TCR publicadas (dibujo gris). Las flechas amarillas indican modos de encuadernación no convencionales. (B) Los colores son como en A. Vista desde arriba de TCR o TCR imitan la unión a pHLA. Los círculos negros representan el centro de encuadernación. Las flechas amarillas indican modos de encuadernación no convencionales.

Recopilación de datos y estadísticas de refinamiento para WT1_α7β2-Estructuras A2-RMF y NYBR1-A2-SLS

Los análisis estructurales de TCR versus TCR imitan la unión a pHLA

El análisis de escaneo de alanina revela distintos patrones de reconocimiento molecular entre los TCR y los anticuerpos que imitan a TCR. Se usó mutagénesis de exploración con alanina para investigar el patrón de reconocimiento molecular de los TCR mejorados por afinidad y los anticuerpos imitadores de TCR usando resonancia de plasmón de superficie (Figura 2 y Figura 1 complementaria). Para cada reactivo, generamos un panel de pHLA solubles en el que cada residuo de péptido se reemplazó con una alanina (o una serina si el residuo nativo ya era una alanina), excepto por los residuos de anclaje canónicos en las posiciones 2 y 9. El 1G4_α58β61 TCR unido a A2-SLL con un KD = 57 pM. Sin embargo, no se detectó unión cuando los residuos 5 y 6 se mutaron a alanina, y la afinidad se redujo sustancialmente cuando se mutaron los residuos 4, 7 y 8 (Figura 2A). Estos hallazgos son consistentes con el 1G4_α58β61-Estructura cristalina cocompleja A2-SLL que muestra que el motivo MW central forma una protuberancia peptídica central, haciendo múltiples contactos con los bucles TCR CDR3, y el residuo peptídico Q8 apunta hacia arriba en dirección opuesta a la superficie HLA, lo que permite contactos con el bucle TCR CDR1β (Figura 1 y Tabla 2). Se observó un patrón similar para el 1G4_α5β51 TCR restringido por A2-SLL (una versión mutante de afinidad diferente de 1G4_α58β61 procedente del mismo progenitor WT TCR, KD = 1,4 nM), con reducciones en la afinidad observadas adicionalmente en las posiciones de péptido 1 y 3, mientras que 1G4_α5β100 TCR restringido por A2-SLL (una versión mutante de afinidad diferente de 1G4_α58β61 originario del mismo progenitor WT TCR), que se unió con una afinidad más débil (KD = 5 nM), era muy sensible a las mutaciones de la alanina en todas las posiciones a lo largo del esqueleto del péptido (Figura 2A). Repetimos el análisis de exploración con alanina en el imitador de TCR 3M4E5 reactivo a A2-SLL e incluimos 2 versiones publicadas de mayor afinidad de 3M4E5 (36) (3M4E5_T2 y 3M4E5_T3) porque tenían una afinidad más cercana a la 1G4_α5β100 y 1G4_α5β51 TCR con afinidad mejorada, lo que permite una comparación más directa. El 3M4E5 (KD = 44 nM en formato de fusión monocatenaria [scFv]) y anticuerpos imitadores de TCR 3M4E5_T2 (KD = 2,8 nM en formato scFv) eran sensibles a la mutación de alanina en los residuos peptídicos 4, 5 y 6 (Figura 2B), mientras que las mutaciones en todas las demás posiciones del péptido no reducían la afinidad de unión. 3M4E5_T3 (KD = 5,5 nM en formato scFv) demostraron una tendencia similar, siendo sensible a la sustitución de alanina en los residuos peptídicos 4 y 5 (Figura 2B). Las sustituciones de alanina en los residuos de péptidos 1, 3, 7 y 8 no tuvieron impacto en la afinidad de unión por ninguno de los imitadores de A2-SLL TCR, lo que demuestra un modo de unión más enfocado alrededor de los residuos de péptidos 4, 5 y 6 en comparación con la afinidad mejorada TCR. Estos hallazgos también fueron consistentes con la estructura cristalina de 3M4E5-A2-SLL que demostró que la unión estaba enfocada hacia estos residuos centrales del péptido.

El análisis de escaneo de alanina revela distintos patrones de reconocimiento molecular entre los TCR y los anticuerpos que imitan a TCR. La contribución de las cadenas laterales de péptidos a la especificidad de unión se analizó usando mutagénesis de exploración con alanina (mediante SPR). Las afinidades de unión de los TCR y los anticuerpos imitadores de TCR se determinaron usando análisis cinético de ciclo único. Los gráficos de barras muestran la afinidad de unión como porcentaje con respecto a la afinidad de unión al péptido índice. (A) TCR con afinidad mejorada A2-SLL, (B) Mimetismos A2-SLL TCR, (C) TCR de afinidad mejorada A1-EVD, (D) Hyb3.3, (mi) TCR con afinidad mejorada A2-RMF y (F) ESK-1. Se muestran datos representativos de 3 experimentos independientes.

También se observó un alto nivel de sensibilidad a las sustituciones de alanina en la estructura del péptido para el MAG-IC3 específico de A1-EVD (KD = 3,8 nM) y MAG-IC5 (una versión mutante de afinidad diferente de MAG-IC3 TCR que se origina del mismo progenitor WT TCR, KD = 17 nM) TCR (Figura 2C). El MAG-IC3 TCR de mayor afinidad demostró una afinidad reducida o abrogada hacia cada mutante de alanina probado, mientras que el MAG-IC5 TCR fue sensible a mutaciones en todas las posiciones, excepto los residuos peptídicos 6 y 7. La estructura cristalina del cocomplejo MAG-IC3-A1-EVD fue consistente con este hallazgo, demostrando una compleja red de contactos a través de la columna vertebral del péptido (Figura 1 y Tabla 2). El anticuerpo que imita a TCR Hyb3.3 reconoce la misma región peptídica que MAG-IC3 y MAG-IC5, pero deriva de una proteína MAGE diferente (MAGE-A1) y se une con una afinidad de KD = 18 nM. Los péptidos MAGE-A3 y MAGE-A1 se conservan en todas las posiciones excepto en el ancla N-terminal (posición 2), posición 5 y posición 8. Aunque la estructura del complejo Hyb3.3-A1-EAD demostró una topología no canónica, las interacciones con el péptido aparente en la estructura eran comparables a la mayoría de los complejos TCR-pHLA (Figura 1 y Tabla 2). Esta observación se reflejó en el análisis de barrido de alanina, que demostró cierto grado de sensibilidad a las sustituciones de alanina en todas las posiciones analizadas, aparte del resto péptido 1 (Figura 2D).

El WT1_α7β2 TCR, que unió A2-RMF con un KD = 70 nM, exhibió unión abrogada o muy reducida para todos los residuos excepto en la posición del péptido 6. El WT1_α27β2 (KD = 13 nM) y WT1_α42β2 (KD = 0,76 nM) TCR (ambas versiones mutantes de afinidad diferentes de WT1_α7β2 TCR procedente del mismo progenitor WT TCR) mostró una tendencia similar, con la unión más fuerte WT1_α42β2 TCR que exhibe el mayor nivel de sensibilidad a las sustituciones de alanina a través de la estructura del péptido (Figura 2E). El anticuerpo ESK1 TCR-imitador, que tiene una afinidad relativamente débil por A2-RMF de KD = 2 μM en formato scFv (Figura complementaria 1), demostró una amplia degeneración en la unión del péptido, siendo tolerante a las sustituciones de alanina en todas las posiciones del péptido excepto para el resto del péptido 1 (Figura 2F). Aquí, la disponibilidad de la estructura ESK-1-A2-WT-1 proporcionó información sobre esta observación, lo que confirma que prácticamente todos los contactos entre ESK-1 y el péptido WT-1 se centraron en el residuo péptido 1 (Figura 1 y Tabla 2).

Los anticuerpos imitadores de TCR se unen a varios autopéptidos expresados ​​comúnmente. Aunque el análisis de exploración con alanina es útil para comprender la sensibilidad posicional de los receptores de dirección pHLA, no está claro cómo estos datos se relacionan con la reactividad cruzada más amplia de estos reactivos, en particular su capacidad para discriminar contra los auto-péptidos comunes. Para obtener más información sobre la autodiscriminación, diseñamos un enfoque experimental para la detección de múltiples complejos pHLA en un formato de alto rendimiento mediante la modificación de la plataforma MagPix. Diseñamos experimentos multiplex utilizando perlas MagPlex recubiertas con HLA en un complejo con una variedad de auto-péptidos comúnmente expresados. Los HLA autopéptidos reconocidos por los TCR mejorados por afinidad o los imitadores de TCR se detectaron usando análisis MagPix (Tablas 3 y 4). En todos los casos, los reactivos de TCR con afinidad mejorada solo generaron una señal contra sus respectivos péptidos índice, mientras que los anticuerpos imitadores de TCR (en formato scFv para evitar la unión mediada por la avidez) fueron más promiscuos. El scFv 3M4E5_T2 fue reactivo contra 4 autopéptidos restringidos de HLA-A * 02: 01 ampliamente expresados, y el scFv ESK1 demostró reactividad contra 6 autopéptidos restringidos HLA-A * 02: 01 ampliamente expresados, además de sus antígenos diana A2 -SLL y A2-RMF, respectivamente (Tabla 3). El scFv Hyb3.3 fue reactivo contra casi todos los autopéptidos restringidos HLA-A * 01: 01 probados (9/12) así como contra A1-EAD (Tabla 4). En todos los casos, los auto-péptidos reconocidos por los anticuerpos imitadores de TCR compartían muy poca similitud de secuencia, revelando un alto nivel de reactividad cruzada potencial en comparación con los TCR mejorados por afinidad desarrollados para apuntar a antígenos peptídicos idénticos o muy similares.

Análisis MagPix de autopéptidos restringidos a HLA-A * 0201 comúnmente expresados

Análisis MagPix de autopéptidos restringidos a HLA-A * 0101 comúnmente expresados

La secuenciación profunda de péptidos de bibliotecas de fagos pHLA aleatorias demuestra la degeneración de la unión de los reactivos dirigidos a pHLA. A pesar de la capacidad de 3M4E5 para unirse a pHLA en una conformación similar a TCR, el perfil de exploración de alanina y el análisis de MagPix revelaron niveles más bajos de selectividad de péptidos en comparación con los TCR de afinidad mejorada. Para probar más esta discrepancia, desarrollamos un enfoque para la caracterización de la degeneración del péptido TCR utilizando bibliotecas de pHLA aleatorias mostradas en fagos (50). Usamos este sistema para identificar preferencias de motivos peptídicos para los TCR mejorados por afinidad y los imitadores de TCR que reconocían A2-SLL. En amplio acuerdo con los análisis de exploración estructural y de alanina, los TCR mejorados por afinidad, 1G4_α5β100, 1G4_α5β51y 1G4_α58β61, mostró fuertes preferencias por la secuencia del péptido SLL nativo en los residuos W5, T7, Q8 y V9 (Figura 3, A – C). Por el contrario, el imitador de TCR 3M4E5 demostró una preferencia por la secuencia del péptido SLL nativo sólo en W5, mostrando todas las demás posiciones muy poca preferencia de aminoácidos (Figura 3, D). Aunque W5 fue seleccionado por 3M4E5_T2 y 3M4E5_T3, no era el aminoácido de preferencia dominante en esta posición, siendo la fenilalanina (F) la preferida por ambos reactivos (Figura 3, E – F). 3M4E5_T2 y 3M4E5_T3 también mostraron muy poca selectividad en términos de preferencia de aminoácidos en cualquier otra posición. Estos hallazgos son consistentes con los resultados del escaneo de alanina que demuestran que los imitadores de TCR reactivos con A2-SLL podrían tolerar sustituciones de alanina en cualquier residuo fuera de la clavija de MW central en el péptido SLL, mientras que los TCR con afinidad mejorada fueron selectivos a través de la estructura del péptido.

La secuenciación profunda de péptidos de bibliotecas de fagos pHLA aleatorias demuestra la degeneración de la unión de los reactivos dirigidos a pHLA. Se generaron logotipos de secuencia (software iceLogo) y mapas de calor a partir de la secuenciación NGS de los datos de la bandeja 3 que identificaban la distribución de las identidades de aminoácidos por posición del péptido seleccionado por los TCR mejorados por afinidad reactiva A2-SLL y los anticuerpos imitadores de TCR. La abundancia de un aminoácido se muestra por la intensidad del color. Los recuadros delineados identifican los aminoácidos del antígeno análogo SLL. Los datos se muestran como el promedio de 2 repeticiones experimentales. (A) 1G4_α5β100, (B) 1G4_α5β51, (C) 1G4_α58β61, (D) 3M4E5, (mi) 3M4E5_T2 y (F) 3M4E5_T3.

Con esta información, evaluamos el número de péptidos únicos seleccionados por cada reactivo para conocer mejor su reactividad cruzada comparativa. El análisis de los datos de secuenciación de próxima generación identificó un promedio de 7068 péptidos únicos (687,241 lecturas totales) para 1G4_α5β51, 4455 péptidos únicos (689,928 lecturas en total) para 1G4_α5β100y 9012 péptidos únicos (696.992 lecturas en total) para 1G4_α58β61. El TCR imita los péptidos seleccionados entre 3 y 15 veces más únicos en comparación con los TCR mejorados por afinidad con 50,765 péptidos únicos (740,196 lecturas totales) para 3M4E5, 60,699 únicos (692,455 lecturas totales) para 3M4E5_T2 y 32,934 únicos (727,824 lecturas totales) para 3M4E5_T3. En general, estos datos sugieren que los TCR mejorados por afinidad A2-SLL tienen menos reactividad cruzada (en términos de número total de péptidos reconocidos) y menos promiscuos en términos de su capacidad para tolerar la variación de aminoácidos en la estructura del péptido en comparación con A2-SLL Imita el TCR.

Las simulaciones de dinámica molecular revelan que la selectividad de péptidos está asociada con modos energéticos distintivos de unión entre los TCR y los anticuerpos que imitan a TCR. Aunque los análisis de escaneo estructural y de alanina proporcionaron información útil sobre el modo de reconocimiento empleado por las moléculas dirigidas a pHLA que se describen aquí, no fueron completamente predictivos de los patrones de reconocimiento observados en el análisis de la biblioteca MagPix y pHLA aleatorizado. Por ejemplo, a pesar de que los imitadores de TCR reactivos con A2-SLL y A1-EAD forman contactos peptídicos aparentemente anchos, de acuerdo con el análisis estructural y perfiles de exploración de alanina prometedores, estos reactivos unieron sustancialmente más auto-péptidos en el análisis MagPix que la afinidad. -TCR mejorados. Además, los imitadores de TCR reactivos con A2-SLL se caracterizaron por una unión de péptidos más degenerada en el análisis de la biblioteca pHLA aleatorizado. En consecuencia, realizamos simulaciones de dinámica molecular (MD) para ampliar la vista de "instantánea" disponible de las estructuras cristalinas. Sometimos las 6 estructuras descritas en la Figura 1 a dos simulaciones MD de 500 nanosegundos de duración para investigar la naturaleza bioquímica y la vida útil de los contactos formados entre el péptido y los TCR mejorados por afinidad o los imitadores de TCR. Las interacciones se diseccionaron en contactos formados entre la cadena lateral del péptido (específico de aminoácido) y la cadena principal (específico de conformación) frente al tiempo y se separaron en interacciones de tipo de enlace de hidrógeno (enlace H) y de van der Waals (vdW). En todos los casos, los TCR mejorados por afinidad hicieron un mayor número de contactos de larga duración con átomos de la cadena lateral a través del péptido en comparación con las interacciones de la cadena principal (Figura 4, A – C). Por el contrario, 3M4E5 hizo un menor número de contactos de la cadena lateral del péptido (Figura 4D), reflejado por una relación general más baja de contactos de la cadena lateral del péptido (relación de enlace H: 0,5, relación vdW: 2,23) en comparación con el 1G4_α58β61 TCR (relación de enlace H: 1,49, relación vdW: 5,41) (Figura complementaria 2). Hyb3.3 prácticamente no hizo contactos con los residuos de la cadena lateral del péptido (relación de enlace H: 0,16, relación vdW: 0,24), centrándose principal o exclusivamente en las interacciones con la estructura del péptido (figura 4E y figura complementaria 2). ESK-1 hizo interacciones peptídicas de la cadena lateral, pero solo con el R1 expuesto, en línea con el análisis de barrido de alanina (Figura 4F y Figura complementaria 2). Estos datos sugieren que los patrones de reconocimiento mediados por cadenas laterales más limitados, como se observa para los imitadores de TCR, podrían contribuir a mayores niveles de degeneración de péptidos.

Las simulaciones de dinámica molecular revelan amplios contactos de cadena lateral con la especificidad de impulso de péptidos. Número relativo de enlaces H e interacciones vdW formadas entre la cadena principal o lateral de cada residuo peptídico y el imitador de TCR / TCR en el transcurso de nuestras simulaciones de MD. Se muestran las relaciones totales de la cadena lateral frente a la principal para los enlaces H y las interacciones vdW, con el valor más grande (lateral o principal para cada categoría) escalado al 100% (los valores absolutos para todos los contactos se proporcionan en la Figura complementaria 2). Las simulaciones MD se realizaron utilizando simulaciones MD independientes (vectores de velocidad aleatorios asignados al calentar) de 500 ns de longitud para cada estructura. (A) 1G4_α58β61-A2-SLL, (B) MAG-IC3-A1-EVD, (C) WT1_α7β2-A2-RMF, (D) 3M4E5-A2-SLL, (mi) Hyb3.3-A1-EAD, (F) ESK-1-A2-RMF.

El paisaje energético de cada complejo TCR / TCR mimético-pHLA mejorado por afinidad se caracterizó mediante el cálculo de sus energías libres de unión (utilizando el método de la mecánica molecular del área superficial de Poisson-Boltzmann [MMPBSA]) (51). El enfoque MMPBSA se ha utilizado ampliamente para predecir energías libres relativas de unión proteína-ligando y proteína-proteína (52, 53). Más específicamente, se ha utilizado para racionalizar el efecto de las mutaciones en los complejos anticuerpo-antígeno (54) y el papel de una interacción puenteada por agua en la afinidad TCR-pHLA (55) y para predecir energías libres de unión relativas confiables de los complejos pHLA ( 56). Aquí, realizamos simulaciones MD de 25 × 4 nanosegundos por complejo para el análisis MMPBSA para garantizar resultados confiables y convergentes (52, 56, 57). Los cálculos de MMPBSA tienen la ventaja de que pueden descomponerse en contribuciones por residuo a la energía libre de unión, lo que permite predecir la preferencia de cada residuo hacia la unión. El análisis de los resultados de la descomposición demostró que los TCR mejorados por afinidad se caracterizaban por firmas energéticas amplias, por lo que la energía de unión se distribuía en al menos 3 residuos de péptidos, con múltiples regiones dispares que impulsaban la afinidad a través de la superficie de HLA (Figura 5, A – C, y Figura complementaria 3, A – C). Por otro lado, los imitadores de TCR estaban más enfocados en HLA, con 1 o 2 puntos calientes energéticos enfocados en residuos de HLA individuales (Figura 5, D – F, y Figura complementaria 3, D – F). Por ejemplo, aunque el 1G4_α58β61 El TCR hizo interacciones energéticas sustanciales con el residuo de HLA R65 (–12 kcal mol -1), esto se equilibró con interacciones con múltiples residuos de péptidos (W5: –11 kcal mol -1, M4: –8 kcal mol -1, Q8: –7 kcal mol –1) y otros residuos de HLA (Q155: –6 kcal mol –1). El MAG-IC3 TCR tenía una huella energética equilibrada con importantes contribuciones de unión de los residuos de HLA E63, N66 y V158, así como los residuos de péptidos E1, D3, P4 y H7 (alrededor de –5 kcal mol –1), y sin energía. Se detectaron puntos calientes para el WT1_α7β2 TCR, con la mayor parte de la energía de unión igualmente equilibrada sobre los residuos de HLA R65, R75 y Q155 y los residuos de péptidos P4, N5 e Y8 (todos alrededor de –6 kcal mol -1). Por el contrario, todos los imitadores de TCR utilizaron una unión energética más enfocada para activar sus pHLA afines. La principal contribución energética de 3M4E5 la realizó el residuo de HLA R65 (–16 kcal mol –1), con un punto caliente de péptido adicional en W5 (–7 kcal mol –1). La unión de Hyb3.3 se caracterizó por fuertes interacciones energéticamente favorables solo con los residuos de HLA K146 (–11 kcal mol –1) y R65 (–11 kcal mol –1), con el péptido EAD jugando un papel menor. Finalmente, para ESK-1, se detectaron puntos calientes energéticos en el residuo de HLA K66 (-15 kcal mol -1) y el residuo de péptido R1 (-13 kcal mol -1), con muy poca contribución de cualquier otro residuo de péptido.

Enlace análisis de descomposición de energía libre de interacciones de TCR y de imitación de TCR-pHLA. Descomposición por residuo de la energía libre de enlace obtenida de nuestros cálculos de MMPBSA para identificar puntos calientes energéticos para cada interacción de imitación de TCR o TCR con pHLA afín. Se muestra una vista de arriba hacia abajo de cada pHLA, con el péptido representado como barras y el HLA como superficie. El mapeo de colores de los resultados de la descomposición para cada residuo se realizó en toda la interfaz de unión y se usó para indicar qué residuos a través de esta interfaz favorecen (azul) o no favorecen (rojo) la unión (con el blanco indicando que no hay preferencia). Los gráficos de barras para todos los resultados de la descomposición se proporcionan en la Figura complementaria 3. Las simulaciones MD se realizaron usando 25 simulaciones MD independientes (vectores de velocidad aleatorios asignados al calentar) de 4 ns de longitud para cada estructura. (A) 1G4_α58β61-A2-SLL, (B) MAG-IC3-A1-EVD, (C) WT1_α7β2-A2-RMF, (D) 3M4E5-A2-SLL, (mi) Hyb3.3-A1-EAD, (F) ESK-1-A2-RMF.

Junto con los análisis anteriores, las simulaciones de MD proporcionan más evidencia de que, en lugar de ser impulsadas por el reconocimiento de un aminoácido dominante en una sola posición en el HLA o péptido, se asociaron amplias interacciones a través del péptido (particularmente con las cadenas laterales del péptido). con mayor selectividad de péptidos.

Eliminación de linfocitos T redirigidos de líneas celulares positivas y negativas al antígeno utilizando biespecíficos dirigidos a pHLA. Se evaluó la reactividad dentro del objetivo frente a fuera del objetivo de los TCR potenciados por afinidad y los imitadores de TCR en ensayos de redireccionamiento de células T funcionales frente a líneas celulares antígeno positivas y negativas. Se evaluaron las líneas celulares para determinar los niveles de transcripción de ARN de los genes que codifican cada proteína para determinar su estado antigénico (Figura 4 complementaria). Se generaron moléculas biespecíficas solubles fusionando un scFv anti-CD3 (KD = 10 nM, semivida = 2 minutos) a la cadena β del 1G4_α con afinidad mejorada58β61 (IMC-1G4_α58β61) y MAG-IC3 TCR (IMC-MAG-IC3) o la cadena pesada del imitador de TCR scFv 3M4E5_T2 (3M4E5_T2 / anti-CD3), 3M4E5_T3 (3M4E5_T3 / anti-CD3) y Hyb3.3 (Hyb3.3 / anti -CD3). Los reactivos que reconocen A2-RMF no se incluyeron porque, de acuerdo con la evidencia de otros estudios (58), no pudimos detectar el péptido en células tumorales WT1 + mediante análisis de espectrometría de masas (datos no mostrados). IMC-1G4_α58β61 La destrucción de células T redirigida de células A2 + NY-ESO + NCIH-1755 fue aproximadamente 20 veces más sensible en comparación con 3M4E5_T2 / anti-CD3 y 3M4E5_T3 / anti-CD3, en consonancia con la diferencia de afinidad entre estos reactivos (Figura 6A y Figura complementaria 5). Sin destrucción de células T redirigida de A2 + NY-ESO: se detectaron dianas para IMC-1G4_α58β61, mientras que 3M4E5_T2 / anti-CD3 y 3M4E5_T3 / anti-CD3 indujeron la muerte de células T redirigidas de las líneas celulares A2 + NY-ESO-negativas al antígeno HEP-G2, Ren8 y HISMC en EC50s similares a los de la línea celular A2 + NY-ESO-1 + NCIH-1755. De manera similar, Hyb3.3 / anti-CD3 demostró la eliminación redirigida de células T de múltiples líneas celulares A1 + MAGE-A1 - antígeno negativas, así como líneas celulares A1 + MAGE-A1 + positivas para antígeno, lo que demuestra que no existe, o es muy pequeña, ventana de especificidad.Por el contrario, la muerte de células T redirigidas mediada por IMC-MAG-IC3 de A1 + MAGE-A3: las células negativas al antígeno estaban ausentes (células HISMC) o solo se produjeron en concentraciones muy altas (COLO205), lo que demuestra una clara ventana de especificidad en comparación con las células redirigidas. Matanza de células T contra células positivas al antígeno A1 + MAGE-A3 + (Figura 6B y Figura 6 complementaria). Estos hallazgos se confirmaron tanto para los reactivos A2-SLL como para los reactivos A1-EAD / EVD en 3 donantes adicionales, lo que demuestra un patrón general de reactividad muy similar (Figura complementaria 4). Finalmente, exploramos si las moléculas ImmTAC podrían generar una señal de activación diferente en las células T CD8 + y CD4 + en comparación con los anticuerpos imitadores de TCR. Las células T CD8 + o CD4 + purificadas de un donante sano se redirigieron contra las células diana A2 + NY-ESO + y A2 + NY-ESO - utilizando IMC-1G4_α58β61 o 3M4E5_T3 / anti-CD3, y se midió la producción de citocinas usando un kit de cultivo de tejido humano TH1 / TH2 10-Plex (figura complementaria 7). En general, los perfiles de citocinas para ambos reactivos fueron consistentes con una respuesta de linfocitos T Th1 CD4 + y linfocitos T CD8 + efectores dirigidos por IFN-γ, mientras que todas las demás citocinas analizadas solo fueron detectables a niveles muy bajos. Anteriormente informamos un patrón similar de activación para las células T CD8 + y CD4 + tras la redirección con moléculas ImmTAC (59), y junto con estos hallazgos, esto indica que el modo de activación de las células T no se ve afectado por la selectividad de estos biespecíficos durante Redirección de células T. Además, no observamos liberación de citocinas para IMC-1G4_α58β61 en respuesta a los objetivos A2 + NY-ESO -, mientras que para 3M4E5_T3 / anti-CD3, se observaron respuestas a los objetivos A2 + NY-ESO - para prácticamente todas las citocinas probadas. Esta activación independiente del objetivo también puede explicar por qué 3M4E5_T3 / anti-CD3 indujo una mayor liberación de citocinas contra los objetivos A2 + NY-ESO + en comparación con IMC-1G4_α58β61, ya que las respuestas a antígenos distintos de A2-SLL para 3M4E5_T3 / anti-CD3 pueden haber dado como resultado un aumento en la abundancia de diana para este reactivo.

Eliminación de linfocitos T redirigidos de líneas celulares positivas y negativas al antígeno utilizando biespecíficos dirigidos a pHLA. La actividad de las moléculas ImmTAC y las fusiones de imitador de TCR / anti-CD3 se ensayó frente a una variedad de líneas celulares antígeno positivas y antígeno negativas (células tumorales y sanas) usando ensayos de destrucción de IncuCyte. Se muestran las PBMC de 1 donante sano. Se utilizaron PBMC de 3 donantes sanos adicionales para repetir el ensayo (Figura 4 complementaria). Los datos se trazan usando el área bajo el análisis de la curva. Las barras de error muestran SD de 3 repeticiones experimentales. (A) IMC-1G4_α58β61, 3M4E5_T2 / anti-CD3 y 3M4E5_T3 / anti-CD3 redirección de células T contra HLA-A * 02: 01 + NY-ESO-1 + (NCI-H1755) y HLA-A * 02: 01 + NY-ESO-1 - Líneas celulares (HEP-G2, Ren8 y HISMC). (B) IMC-MAG-IC3 y Hyb3.3 / redirección de células T anti-CD3 contra HLA-A * 01: 01 + MAGE-A3 + (HCC1428 y NCI-H1703), HLA-A * 01: 01 + MAGE-A1 + (HCC1428 y NCI-H1703) y líneas celulares HLA-A * 01: 01 + MAGE - (COLO205 y HISMC).

En general, los biespecíficos dirigidos a HLA basados ​​en el andamio de TCR natural retuvieron niveles más altos de especificidad en las pruebas celulares, de acuerdo con los análisis de bibliotecas de pHLA y MagPix aleatorizados. Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que los contactos de péptidos dispersos con la firma energética centrada en la cadena lateral del péptido comparativamente amplia son predictivos de la capacidad de discriminar entre diferentes péptidos.

El NYBR1 TCR no exhibe reactividad celular fuera del objetivo y utiliza un modo de unión centrado en la cadena lateral de péptidos amplio. Para probar la noción de que la selectividad de péptidos está asociada con contactos amplios con cadenas laterales de péptidos y un perfil energético disperso, ampliamos nuestro análisis para incluir un TCR de afinidad mejorada que se sabía que era altamente selectivo para su pHLA objetivo. El NYBR1 TCR fue madurado por afinidad contra un péptido restringido HLA-A * 02: 01 específico del cáncer (SLSKILDTV en este documento denominado péptido SLS) derivado del antígeno del linaje NY-BR-1 y utilizado para generar una molécula ImmTAC (IMC-NYBR1 ). En las pruebas celulares, según lo evaluado tanto por la liberación de IFN-γ como por la muerte de las células diana, IMC-NYBR1 demostró una especificidad exquisita, como lo demuestra la ausencia de redirección de células T contra 10 líneas celulares A2 + NY-BR-1 - antígeno negativas, incluso en altas concentraciones (hasta 2 nM de IMC-NYBR1 para un KD = Reactivo de afinidad 47 pM) (Figura 7A). Resolvimos la estructura del complejo NYBR1-A2-SLS a una resolución de 2.3 Å (Tabla 1), que demostró que NYBR1 se unía canónicamente, con un ángulo de cruce normal (63.6 °) y un BSA ligeramente por encima del rango reportado (2835Å 2), acoplarse con 7 de los 9 residuos de péptidos (32% de contactos de péptidos) (Figura complementaria 8A). Este modo de unión permitió una especificidad fina a través del péptido, evidenciada por la sensibilidad a las sustituciones de alanina en cada posición del péptido aparte de la posición 1 del péptido (Figura 7B). El análisis de contactos y energía de las simulaciones de MD demostró una interacción mediada por cadena lateral altamente peptídica (Figura complementaria 8, B – D), con importantes contribuciones de 6 de los 9 residuos en el péptido SLS. Aunque hubo un ligero enfoque energético hacia el residuo HLA Q155 (–6 kcal mol –1) y el residuo peptídico K4 (–9 kcal mol –1), se realizaron una serie de contribuciones energéticas en toda la superficie del HLA y el péptido. Por lo tanto, de acuerdo con nuestras otras observaciones en este estudio, la especificidad fina del NYBR1 TCR se asoció con un modo de unión energético amplio caracterizado por interacciones con múltiples cadenas laterales de péptidos.

El NYBR1 TCR no exhibe reactividad celular fuera del objetivo y es sensible a las sustituciones de alanina a través de la estructura del péptido. (A) La actividad de IMC-NYBR1 se probó frente a un rango de HLA-A * 02: 01 + NYBR1 + (CAMA1 y CAMA1 β2m) y HLA-A * 02: 01 + NYBR1– líneas celulares (MDA-MB-231, HA13, HAo14, HDMEC2, Ren8, CM12 HCC1419, NCI-H661, SNU475 y SNU398) usando IFN-γ ELISpot (gráficos de barras ) y ensayos de destrucción de IncuCyte (análisis del área bajo la curva) en 2 donantes. Las barras de error muestran SD de 3 repeticiones experimentales. (B) La contribución de las cadenas laterales de péptidos a la especificidad de unión se analizó usando mutagénesis de barrido de alanina (mediante resonancia de plasmón de superficie). Las afinidades de unión de la interacción NYBR1-A2-SLS se determinaron usando análisis cinético de ciclo único. Los gráficos de barras muestran la afinidad de unión como porcentaje con respecto a la afinidad de unión al péptido índice.

La identificación de objetivos específicos de cáncer para tumores sólidos es un desafío porque los antígenos de la superficie celular a menudo se expresan en una amplia gama de tejidos. Moléculas como CD19 y otras han demostrado ser dianas eficaces para los tumores líquidos porque la toxicidad en la diana se limita principalmente a las células hematopoyéticas que pueden repoblarse de la médula ósea después del tratamiento (60). Otra fuente clave de antígenos son las proteínas intracelulares desreguladas o mutadas. Sin embargo, muchas de estas proteínas solo se presentan en la superficie celular en el contexto de pHLA. Es interesante observar que, incluso en respuesta a patógenos humanos muy comunes (es decir, influenza), no se han detectado anticuerpos naturales que reconocen pHLA, lo que sugiere que las respuestas humorales a pHLA son ineficaces o peligrosas para el huésped. A diferencia de los anticuerpos, los TCR se seleccionan para reconocer el pHLA en el timo, lo que elimina las células T con los TCR que se unen fuertemente al auto-pHLA (y presumiblemente elimina los TCR que se unen de forma independiente del péptido). Este proceso está controlado en parte por el coenganche de HLA por los correceptores de células T CD8 y CD4, cuya eliminación en ratones knockout de correceptores CD8 / CD4 ha demostrado que permite la selección de células T con TCR que pueden unirse a proteínas no MHC, como como CD155 (61, 62). Varios informes recientes también han sugerido que, probablemente como consecuencia de la selección tímica, los TCR han coevolucionado para reconocer el pHLA (63 - 65). Este modelo de "coevolución" es consistente con los hallazgos de un estudio reciente que revela que los TCR tienen una orientación de dominio variable única en comparación con los anticuerpos, cuya ausencia podría restringir que los anticuerpos reproduzcan la capacidad natural de los TCR para discriminar entre diferentes péptidos presentados por HLA (66 ). Por lo tanto, los TCR tienen múltiples mecanismos de selección únicos y características estructurales que guían el reconocimiento de pHLA. Hemos demostrado previamente que los TCR mejorados por afinidad mantienen muchas de las características de unión de sus progenitores WT seleccionados tímicamente, con una unión más fuerte generalmente impulsada a través de la formación de nuevas interacciones tanto con el péptido como con la superficie HLA (13, 44, 45, 67 - 69). Esta característica probablemente proporciona una ventaja para generar TCR mejorados por afinidad con la capacidad de retener un perfil de especificidad similar en comparación con los TCR naturales seleccionados tímicamente.

La literatura indica que la potencia de las células T está ajustada por un umbral de afinidad de TCR que es óptimo en el rango de micromolar bajo a nanomolar alto (17, 34, 70 - 74). Para los reactivos biespecíficos solubles, este umbral de afinidad se controla en el extremo efector de la molécula, mientras que la afinidad del extremo de dirección de pHLA debe optimizarse para lograr la potencia de acuerdo con la ocupación del receptor. Para la mayoría de los pHLA asociados a tumores, sus niveles de presentación natural pueden ser muy bajos (a menudo por debajo de 10 copias de cada epítopo peptídico específico por célula) (3, 33). En consecuencia, se necesita una unión en el rango de afinidad femto a picomolar para lograr un nivel de ocupación del receptor terapéuticamente relevante: una hazaña que se ha logrado para los biespecíficos monovalentes basados ​​en TCR (22, 24). La literatura, junto con los datos presentados aquí, sugiere que, con las tecnologías actuales, diseñar un anticuerpo imitador de TCR para lograr este rango de afinidad mientras se mantiene la selectividad del péptido es más desafiante (32). Algunos imitadores de TCR solubles se han diseñado como anticuerpos completos, logrando así una unión mucho más fuerte a través de efectos de avidez (38). Sin embargo, esto esencialmente reduce a la mitad el número de moléculas efectoras por célula diana, un problema importante si los niveles de presentación de antígenos ya son limitantes.

Aquí, interrogamos la base molecular del reconocimiento pHLA de un panel de biespecíficos de redireccionamiento de células T utilizando una combinación de enfoques estructurales, bioquímicos y computacionales. Todos los TCR de afinidad mejorada utilizaron un modo de unión canónico nativo similar al TCR, manteniendo amplios contactos a través de la estructura del péptido. Este hallazgo probablemente representa la ventaja de usar reactivos que se han desarrollado a partir de un progenitor de TCR seleccionado tímicamente. Nuestros datos también revelan que un modo de unión de tipo nativo es necesario, pero no suficiente, para permitir la selectividad de péptidos. Por ejemplo, a pesar de que el TCR 3M4E5 imita la unión de una manera casi idéntica a un TCR nativo, con contactos peptídicos a través de la estructura del péptido, todavía se desempeña mal en los ensayos de reactividad cruzada celular. Nuestro análisis de simulación MD demostró que 3M4E5 se unía a través de 2 puntos calientes principales: 1 en el residuo peptídico W5 y 1 en el residuo HLA R65. Estos hallazgos se reflejaron en el análisis aleatorio de la biblioteca pHLA que demostró que los imitadores de TCR reactivos con A2-SLL eran todos más degenerados (en términos de preferencias de aminoácidos en la estructura del péptido) en comparación con los TCR mejorados por afinidad reactivos con A2-SLL y se predijo que seleccionarían un número mucho mayor de secuencias de péptidos únicas. Curiosamente, este modo de unión mediado por puntos calientes también se ha observado para algunos TCR naturales, pero se ha demostrado que se correlaciona con altos niveles de reactividad cruzada de TCR y se ha implicado en la autoinmunidad (49, 75). Los imitadores de ESK-1 y Hyb3.3 TCR también emplearon modos de unión de puntos calientes, especialmente enfocados hacia residuos en la superficie de HLA, y demostraron pérdida de selectividad de péptidos en bioquímicos (ESK-1 e Hyb3.3) y celulares (Hyb3.3 ) pruebas. En contraste, todos los reactivos basados ​​en TCR probados exhibieron una selectividad de péptido superior en pruebas bioquímicas y celulares y se caracterizaron por modos de unión que incluían una mayor combinación de interacciones energéticas equilibradas a través de las superficies de péptido y HLA. Esto fue ejemplificado por el NYBR1 TCR (con mucho, la molécula más limpia probada tanto en el análisis molecular como en el celular), que también demostró un modo de unión energético amplio, con la mayoría de los contactos peptídicos a través de interacciones de cadena lateral. Aunque los imitadores de TCR seleccionados en este estudio se generaron utilizando un enfoque diferente de los TCR mejorados por afinidad, nuestros datos sugieren que los reactivos basados ​​en el andamio de TCR natural fueron más capaces de discriminar entre diferentes péptidos utilizando interacciones de unión específicas de péptidos.

A pesar de que nos centramos en 3 anticuerpos imitadores de TCR publicados debido a las estructuras disponibles (25, 31, 36), nuestros datos también tienen implicaciones para otros estudios publicados de imitadores de TCR. Por ejemplo, se ha demostrado que la ESK-1 imitadora de TCR se dirige al antígeno del tumor de Wilms en modelos de ratón (29, 38), a pesar de la evidencia que demuestra que el antígeno A2-RMF no se expresa (58). Este hallazgo, combinado con los datos que se muestran aquí, sugiere que las actividades informadas para ESK-1 pueden estar mediadas por el reconocimiento de otro péptido o de una manera independiente del péptido. Aunque está claro que la selectividad de pHLA de ingeniería sigue siendo uno de los principales desafíos para los imitadores de TCR (76), existen reactivos emergentes que exhiben perfiles de especificidad más prometedores, incluidos los reactivos dirigidos a un LMP2A de EBV restringido por HLA-A * 02: 01426–434 (CLGGLLTMV) epítopo (77) y una α-fetoproteína158–166 (FMNKFIYEI) (78), el segundo de los cuales ha entrado en ensayos clínicos como un CAR para el tratamiento del cáncer de hígado. Nuestros datos demuestran la importancia de las pruebas de especificidad sólidas de las moléculas dirigidas a pHLA, en línea con nuestro propio paquete de pruebas de seguridad preclínicas (79), que deben tenerse en cuenta para el desarrollo de biespecíficos solubles dirigidos a pHLA.

En resumen, demostramos que al combinar datos estructurales y bioquímicos con simulaciones atomísticas de MD, las interacciones que sustentan el reconocimiento de pHLA se pueden analizar en detalle y se pueden utilizar para comprender mejor la especificidad de los reactivos dirigidos a pHLA. Aunque estos hallazgos deben validarse aún más utilizando modelos de tumores in vivo, amplían nuestra comprensión de las reglas moleculares que determinan el reconocimiento selectivo de pHLA y arrojan luz adicional sobre cómo los TCR se involucran con pHLA de una manera dependiente de péptidos. Finalmente, estas observaciones también resaltan los desafíos asociados con la ingeniería de moléculas dirigidas a pHLA que realmente pueden imitar la especificidad similar al TCR.

Líneas celulares. Las células presentadoras de antígeno COLO205, HCC1428, NCI-H1703, NCI-H1755, NCI-H1944, NCI-H2087, NCI-H441 y T2 (LCL721 × CEM-C7) se compraron en ATCC y se cultivaron en RPMI complementado con FCS al 10% , L-glutamina 2 mM y penicilina / estreptomicina al 1% (v / v). Las células HEP-G2 se adquirieron de ATCC y se cultivaron en EMEM suplementado con FCS al 10%. Se adquirieron células HISMC y HREpic8 (Ren8) de ScienCell y se cultivaron en medio de células de músculo liso o medio de células epiteliales, respectivamente. La autenticación de líneas celulares y las pruebas de micoplasmas se llevaron a cabo de forma rutinaria por el Servicio de autenticación de líneas celulares de estándares LGC (www.lgcstandards.com) y Mycoplasma Experience Ltd. (www.mycoplasma-exp.com), respectivamente.

Ingeniería TCR. Para obtener TCR con afinidad mejorada para HLA-A * 02: 01 SLLMWITQC (NY-ESO-1157–165), HLA-A * 01: 01 EVDPIGHLY (MAGE-A3161–134) y HLA-A * 02: 01 RMFPNAPYL (WT-1126–134), los TCR WT 1G4, MAGE-A3 y WT1 se sometieron a presentación de fagos, como se describió anteriormente (24). Se obtuvo un panel de TCR de alta afinidad con mutaciones en la cadena α y / o β (datos no mostrados). Los TCR de estos paneles se seleccionaron para este estudio de acuerdo con su similitud en afinidad con los anticuerpos imitadores de TCR disponibles. Además, se seleccionaron algunos TCR modificados por ingeniería de afinidad más fuertes de acuerdo con la disponibilidad de las estructuras del complejo TCR-pHLA correspondientes para permitir comparaciones estructurales directas con los anticuerpos imitadores de TCR.

Diseño de construcciones, expresión de proteínas y purificación. Los TCR modificados, el TCR imita, β2m, y las cadenas pesadas HLA-A * 01: 01 y HLA-A * 02: 01 se clonaron en el vector pGMT7 y se expresaron en BL21 (DE3) Rosetta pLysS E. coli cepa como se describió anteriormente (16, 80). Las construcciones de TCR para el análisis biofísico se diseñaron para incluir los dominios variables y constantes de ambas cadenas (α y β) con un enlace disulfuro intercadena diseñado (23). Los reactivos de anticuerpos para el análisis biofísico se generaron como scFv con un enlazador entre las cadenas pesadas y ligeras variables (los dominios constantes no se incluyeron en la construcción). El casete de expresión Hyb3.3 scFv se clonó en pCEP4 y la proteína se expresó en células de mamíferos utilizando el sistema de expresión ExpiCHO (Thermo Fisher Scientific), ya que no se expresó en mi. coli. Se generaron construcciones de TCR para experimentos de redireccionamiento de células T con un scFv anti-CD3 fusionado a la cadena TCR-β (moléculas ImmTAC, tamaño total

75 kDa) (22). Las construcciones de anticuerpos imitadores de TCR para experimentos de redireccionamiento de células T se diseñaron como scFv con un scFv anti-CD3 fusionado a la cadena pesada (tamaño total

Análisis de la reactividad de las células T dentro y fuera del objetivo mediante la redirección utilizando reactivos biespecíficos anti-pHLA / anti-CD3. La actividad de las moléculas ImmTAC (fusiones de scFv de TCR-CD3) y las fusiones de scFv de scFv-CD3 que imitan a TCR se evaluó a través de su capacidad para redirigir las células T contra una variedad de líneas celulares antígeno positivas y negativas (células tumorales y sanas). . Los ensayos de eliminación de IncuCyte se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sartorius). Para el análisis de citocinas multiplex, se aislaron células T CD4 + y CD8 + de donantes sanos mediante separación magnética utilizando kits de selección negativa siguiendo las instrucciones del fabricante (Miltenyi).

Detección de péptidos MagPix. Los TCR mejorados por afinidad y los scFv de imitación de TCR se sometieron a análisis de reactividad cruzada de péptidos usando un kit de perlas MagPlex (Invitrogen). Varios péptidos comunes expresados ​​por células sanas se replegaron con HLA-A * 02: 01 marcado con biotina o HLA-A * 01: 01 marcado con biotina (detallado en las Tablas 3 y 4). Los imitadores de TCR / TCR codificados por fagémidos se expresaron en la superficie del bacteriófago M13, se fusionaron con la proteína de la cápside pIII (81) y se analizaron la unión a complejos autopéptido-HLA biotinilados unidos a perlas magnéticas MagPlex conjugadas con neutravidina. Las perlas unidas positivamente se identificaron mediante análisis MagPix usando un anticuerpo g8p de proteína de cubierta de bacteriófago anti-M13 conjugado con PE específico de fago (RL-ph2, 2B Scientific Limited, MUB0604) conjugado con R-ficoeritrina usando un kit de conjugación (Abcam, ab102918). Los péptidos que generaban una señal por encima del fondo (3 veces la intensidad media de todas las regiones de perlas unidas al fago auxiliar nativo) se clasificaron como ligantes positivos y la unión se expresó como un porcentaje de la señal obtenida en relación con el péptido índice. Los promedios de las mediciones por triplicado para cada interacción se determinaron dentro de cada experimento, y el porcentaje de unión para cada interacción se informa como el promedio de varias repeticiones experimentales.

Análisis cinético de ciclo único SPR.Los TCR purificados y los scFv imitadores de TCR se sometieron a análisis SPR usando un BIAcore3000 con análisis cinético de ciclo único, como se informó anteriormente (67, 69).

Panorámica utilizando bibliotecas scHLA. Las bibliotecas de scHLA se generaron como se describió previamente (50). TCR mejorados por afinidad biotinilados (1G4_α5β100, 1G4_α5β51y 1G4_α58β61) y anticuerpos imitadores de TCR (3M4E5, 3M4E5_T2 y 3M4E5_T3) se capturaron en perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina y se incubaron con la biblioteca de partículas de fago purificadas prebloqueadas en tampón MPBS al 3%. Las partículas de fago se eluyeron en tripsina y se utilizaron para infectar TGI en fase logarítmica temprana. mi. coli células y se sembraron en placas YTEag a 30 ° C durante 16 horas. Se realizaron tres rondas de selección.

Secuenciación profunda de bibliotecas pHLA. El ADN se aisló de cada solución madre de glicerol mediante Miniprep (kit Zymoprep II, Zymo Research). Se prepararon bibliotecas de secuenciación con indexación molecular basada en un método descrito anteriormente (82). Las bibliotecas se secuenciaron usando la química Illumina V3 SBS en el secuenciador MiSeq. La llamada base y la demultiplexación de muestras se realizaron utilizando el reportero MiSeq para generar archivos fastq y se procesaron con un proceso de análisis personalizado. El análisis del repertorio de péptidos se realizó usando Excel, y los logotipos de secuencia se generaron usando la herramienta independiente iceLogo (83). El análisis de agrupación de secuencias se realizó con GibbsCluster, versión 2.0, servidor web utilizando la configuración predeterminada (84).

Cristalografía de rayos X. Los cristales se cultivaron a 18 ° C mediante difusión de vapor mediante la técnica de gota sentada. Todos los experimentos de selección y optimización de cristalización se completaron con un robot dispensador Art Robbins Phoenix (Alpha Biotech Ltd.). Se añadieron 200 nL de complejo de TCR-pHLA de 10 a 15 mg / ml mezclado en una relación molar de 1: 1 a 200 nL de solución de depósito. A continuación, se sellaron las placas INTELLI-PLATES y se incubaron en una incubadora de cristalización a 18ºC (RuMed, Rubarth Apperate GmbH) y se analizaron para determinar la formación de cristales usando un Rock Imager 2 (Formulatrix). Los cristales seleccionados para un análisis adicional se crioprotegieron con etilenglicol al 25% y luego se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido en Lithobucles (Molecular Dimensions). Para WT1_α7β2-A2-RMF, se obtuvieron cristales óptimos en HEPES 0,1 M pH 7, amonio 0,1 M, 20% v / v Sok-CP7. Para NYBR1-A2-SLS, se obtuvieron cristales óptimos en la condición B07 del Pact premier (dimensiones moleculares) (cloruro de sodio 0,2 M, pH 6,0, MES 0,1 M y PEG 6000 al 20%). Los datos de difracción se recopilaron en varias líneas de luz diferentes en la fuente de luz Diamond utilizando un detector Dectris Pilatus 6M. Utilizando el método de rotación, se registraron 1000 fotogramas, cada uno cubriendo 0,2 ° de rotación. Las intensidades de reflexión se estimaron con el paquete XIA2 (45, 46) y los datos se escalaron, redujeron y analizaron con AIMLESS y el paquete CCP4 (47). Las estructuras del complejo TCR / pHLA se resolvieron con reemplazo molecular usando Phaser (49), usando PDB 4I4W como modelo inicial para pHLA y PDB 3O4L como modelo inicial para NYBR1 TCR. El código de acceso para las estructuras cristalinas informadas en este estudio se cargó en la base de datos del banco de datos de proteínas de RCSB (PDB WT1_α7β2-A2-RMF: 6RSY y NYBR1-A2-SLS: 6R2L).

Simulaciones MD y cálculos MMPBSA. Se realizaron simulaciones periódicas de límites y cálculos MMPBSA con el conjunto de programas Amber16 (85). Las estructuras cristalinas de rayos X de los 7 complejos TCR / Fab-pHLA investigados se utilizaron como puntos de partida para las simulaciones de MD. Los residuos faltantes se agregaron utilizando Modeller, versión 9 (86). Se usó MolProbity para modificar los estados de tautomerización de histidina (los estados de tautomerización usados ​​se pueden encontrar en la Tabla complementaria 2) y las orientaciones de la cadena lateral Asn / Gln bajo los criterios de optimización de la red interna de enlaces H. Se usó PropKa, versión 3.0 (87), para verificar los estados probables de protonación de todos los residuos titulables para pH 7 (todos los residuos se modelaron en sus estados de protonación estándar). Cada sistema se solvató en una caja rectangular de agua (con todas las aguas cristalográficas retenidas) que se extendía al menos a 10 Å de cualquier átomo de proteína. Se añadieron iones de sodio o cloruro según fuera necesario para neutralizar la carga total del sistema. Los campos de fuerza ff14SB (88) y TIP3P (89) se utilizaron para describir moléculas de proteína y agua, respectivamente. Después de la minimización, calentamiento y equilibrio (consulte la sección Métodos complementarios Procedimiento de equilibrado de estructuras), cada sistema se sometió a dos simulaciones MD de producción de 500 ns (vectores de velocidad aleatorios asignados al calentar) en el conjunto NPT (1 atm, 298 K). Las simulaciones MD de producción se ejecutaron con el algoritmo SHAKE aplicado, un intervalo de tiempo de 2 fs y una frecuencia de colisión de 1 ps −1. Se aplicó un corte no adherido de espacio directo de 8 Å con electrostática de largo alcance evaluada utilizando el algoritmo de Ewald de malla de partículas (90). El enlace H (incluidos los enlaces de hidrógeno con puentes de agua) y las interacciones vdW se evaluaron a partir de instantáneas guardadas cada 10 ps, ​​utilizando los últimos 450 ns de cada trayectoria (900 ns por TCR / Fab-pHLA). Un enlace H se definió como si la distancia del aceptor donante estaba dentro de 3,0 Å y el ángulo del aceptor de hidrógeno donante estaba dentro de 45 ° a 180 °. Una interacción vdW se definió como si 2 átomos pesados ​​estaban dentro de 4 Å entre sí.

Estadísticas. La metodología detallada se describe en el Procedimiento de equilibrado de estructuras sección de Métodos suplementarios.

Aprobación del estudio. Las PBMC se obtuvieron de voluntarios sanos. El protocolo Oxford A REC-aprobado 13 / SC / 0226 se utilizó para obtener el consentimiento por escrito para todas las donaciones de sangre y fue totalmente aprobado por el Comité Nacional de Ética en Investigación South Central.

CJH, RMC, JMP, BDW, AL, N Lissin, EAP, KAL, THB, SH, PJC, MH, RJP, TES, BC, AJ, PEM, AV, MS, MA, N Liddy, RAR, SH, VS, ML, CRP, MWVDK, PJR, BKJ y DKC realizaron y / o dirigieron experimentos, analizaron datos y criticaron el manuscrito. DKC y BKJ concibieron y dirigieron el proyecto. DKC escribió el manuscrito.

Los autores desean agradecer a Diamond Light Source por el tiempo del haz y al personal por su ayuda con las pruebas de cristal y la recopilación de datos. Los autores también desean agradecer a Kate Lowe, Ita O’Kelly y Michelle McCully por leer críticamente el manuscrito. La beca de RMC está financiada por el Consejo de Investigación en Ingeniería y Ciencias Físicas (EPSRC). MWVDK es miembro del Consejo de Investigación de Biotecnología y Ciencias Biológicas (BBSRC) David Phillips (BB / M026280 / 1). Esta investigación hizo uso del Servicio de Computación de Alto Rendimiento (HPC) de Balena en la Universidad de Bath, así como de las instalaciones computacionales del Centro de Investigación en Computación Avanzada de la Universidad de Bristol.

Conflicto de intereses: CJH, JMP, BDW, AL, N. Lissin, KAL, THB, SH, PJC, EAP, MH, RJP, TES, BC, AJ, PEM, AV, MS, MA, N. Liddy, RAR, SH, VS, ML, BKJ y DKC son empleados de Immunocore LTD.


Los anticuerpos monoclonales reconocen diferentes partes del ADN-Z.

Poli bromado (dG-dC). Se usó poli (dG-dC), que forma una hélice de ADN-Z estable en condiciones salinas fisiológicas, como antígeno para producir anticuerpos monoclonales a partir de ratones. Los anticuerpos anti-ADN-Z eran específicos para la conformación Z como se demostró mediante estudios de unión directa y un ensayo en fase sólida competitivo. La competencia solo podía ser vista por poli bromado (dG-dC). poli (dG-dC) en condiciones de baja y alta salinidad y poli (dG-dC) sin modificar. poli (dG-dC) en condiciones de alta salinidad. No se pudo ver unión a varios otros polinucleótidos, incluido el ADN nativo y desnaturalizado. Entre los anticuerpos monoclonales anti-Z-ADN, los ejemplos diferían en especificidad: la unión de un anticuerpo monoclonal se bloqueó por metilación de citosina, mientras que el otro anticuerpo reaccionó igualmente bien con el polímero no modificado o con el polímero que contiene metilcitosina en alta fuerza iónica. Los dos anticuerpos son específicos para diferentes características localizadas de la estructura del ADN-Z.


MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas de ratón

C57BL / 6 (B6) (H-2 b / b Fv2 r / r Rfv3 r / r ), BALB / c (H-2 d / d Fv2 s / s Rfv3 s / s ) y A.BY (H-2 b / b Fv2 s / s Rfv3 s / s ) se adquirieron de The Jackson Laboratory. Se retrocruzaron ratones deficientes en Apobec3, construidos utilizando la línea celular embrionaria de trampa de genes XN450 (BayGenomics) durante 8 generaciones en el fondo B6 (10). Los estudios con ratones se realizaron en total conformidad con las políticas institucionales de UCSF y UCD con respecto al cuidado y uso de los animales.

PCR en tiempo real

Se purificaron células eritroides, B, T, mieloides y dendríticas a partir de esplenocitos B6 y células de médula ósea utilizando perlas magnéticas unidas a anticuerpos contra Ter119, CD19, CD90.2 (Thy1.2) y CD11c, respectivamente (Miltenyi Biotec). El ARN de estas subpoblaciones de células se extrajo utilizando el kit RNAEasy (Qiagen) y se sometió a Taqman RT-PCR cuantitativa. Los cebadores mA3.F (5 & # x02032-CTGCCATGGACCTATACGAA) y mA3.R (5 & # x02032-TCCTGAAGCTT AGAATCCTGGT) se encuentran en los exones 3 y 4 de Apobec3 y amplificar un fragmento de 124 pb. Estos cebadores, incluida la sonda Taqman mA3.P (5 & # x02032FAM-CCAAGGCCTGAATCGCCTGC-TAMRA-3 & # x02032) se conservan entre Rfv3 cepas resistentes (B6) y susceptibles (A.BY, BALB / c). El ARN total (10 ng) se transcribió de forma inversa utilizando el cebador mA3.F utilizando el kit de transcripción inversa RT 2 (SABiosciences). Se sometieron muestras de ADN complementario (ADNc) a PCR cuantitativa mezclando 2 & # x003bcl de ADNc con 20 nM de mA3.F y mA3.R, 20 nM de mA3.P y 1x de Taqman Universal Master Mix (Applied Biosciences) en una reacción de 22 & # x003bcl. Las condiciones del ciclo consistieron en un paso de activación de arranque en caliente a 95 ° C durante 15 minutos, seguido de 40 ciclos de 94 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 60 segundos. Los niveles de beta-actina se cuantificaron utilizando 10 nM de cebadores de beta-actina de ratón (SA Biosciences, nº de catálogo PPM02945A), seguido de PCR cuantitativa utilizando SYBR green. Relativo Apobec3 Los niveles de ARNm se calcularon utilizando una ecuación de potencia (CT vs. cantidad logarítmica, r 2 & # x0003e0,98) basado en una curva estándar en placa generada a partir de diluciones en serie de un plásmido de expresión de Apobec3 con número de copias conocido, y los valores se normalizaron frente a los niveles de entrada de beta-actina.

Hapten inmunización

B6 Apobec3 + / + y Apobec3 & # x02212 / & # x02212 ratones (& # x0003e4 meses) y (B6 Apobec3 + / + x BALB / c) F1 y (B6 Apobec3 & # x02212 / & # x02212 x BALB / c) F1 (6 & # x020138 semanas de edad) se inmunizaron ratones intraperitonealmente (i.p.) con 100 & # x003bcg de NP conjugado con gammaglobulina de pollo (NP26-CGG) (Biosearch Technologies) en Imject alum (Pierce). Las muestras de plasma se recolectaron 2 y 4 semanas después del cebado y refuerzo. En algunos experimentos, el refuerzo de NP fue precedido por una infección con 7500 SFFU de stock de FV. Las muestras de plasma se sometieron a un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) utilizando albúmina de suero bovino conjugada a baja (NP3 o NP4) o niveles altos (NP33 o NP23) de hapteno de nitrofenilo por molécula (Biosearch Technologies). Se espera que los anticuerpos específicos de NP totales (tanto de baja como de alta afinidad) se unan a CGG fuertemente sustituido con NP, mientras que solo se espera que los anticuerpos específicos de NP de alta afinidad se unan a CGG que contenga una sustitución de NP de bajo nivel. Por tanto, la relación de los títulos de unión para la CGG sustituida con NP bajo frente a la de alto NP (o la & # x0201cNP-reactivity ratio & # x0201d) proporciona una medida fiable de la afinidad de unión. Este enfoque se validó previamente utilizando un panel de anticuerpos monoclonales específicos de NP, que reveló una fuerte correlación positiva entre la relación de reactividad NP y la afinidad de unión de los anticuerpos monoclonales a NP medida por radioinmunoensayo competitivo (30), calorimetría de titulación isotérmica (31 ) y resonancia de plasmón superficial (32). Es importante destacar que un aumento en la relación de reactividad NP después del refuerzo de NP se acompaña de una hipermutación somática aumentada del locus VH186.2 de células B específicas de NP en centros germinales (27 & # x0201329). Brevemente, se recubrieron 100 ng de NP-BSA en placas Immulon-4 de 96 pocillos durante la noche, seguido de bloqueo durante & # x0003e2 horas con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween-20 al 0,05% (PBS-T). Se incubaron diluciones en serie de 10 veces de plasma en PBS a 37 ° C durante 2 horas, se lavaron 3 veces con PBS-T, luego se incubó una dilución 1: 50.000 & # x020131: 250.000 de anti-IgG1 de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (Betil). durante 1 hora a 37 & # x000b0C. Después de 3 lavados con PBS-T, las muestras se revelaron con sustrato TMB (Sigma) y se dejaron de usar 2N H2ASI QUE4. Las absorbancias se leyeron a 450 nm y se usaron para construir curvas de unión. Las concentraciones de unión al 50% se estimaron gráficamente utilizando Microsoft Excel. Las afinidades de unión relativas se estimaron dividiendo la concentración de unión al 50% frente al hapteno molar bajo (NP3 o NP4) sobre hapteno molar alto (NP33 o NP23) y multiplicar estas relaciones de reactividad NP por 100.

Infección por FV

Las reservas de FV se prepararon y titularon como se describió anteriormente (6). El stock de FV original que se utilizó para describir (6), caracterizar (33, 34), mapear (7 & # x020139) e identificar molecularmente (11, 21) Rfv3 contenía tres virus: un virus de leucemia murina Friend con capacidad de replicación, un virus formador de enfoque del bazo defectuoso en la replicación y un virus que eleva la lactato deshidrogenasa (LDV), un virus de ARN de cadena positiva (35, 36). Aunque existe un stock de virus libre de LDV, el stock de LDV-plus se utilizó para permitir correlaciones válidas con el historial Rfv3 fenotipo. Los estudios se realizaron en ratones congénicos B6 de forma predeterminada para garantizar que Apobec3 esté completamente ausente (Rfv3 las cepas susceptibles aún pueden expresar Apobec3 residual). Sin embargo, la cepa B6 es muy resistente a la infección por FV debido a la Fv2 fenotipo r / r. Por lo tanto, los experimentos destinados a evaluar directamente la infección por FV, en particular mediante citometría de flujo, se realizaron en pacientes altamente susceptibles (B6 x A.BY) F1 ratones, una cepa prototípica de ratón utilizada para estudiar las respuestas inmunitarias del FV, incluida la Rfv3 fenotipo (6). Los ratones (& # x0003e4 meses de edad, tanto machos como hembras) se infectaron con 1400 (B6 x A.BY) F1 o 7500 (B6) unidades formadoras de focos de bazo (SFFU) de virus por vía intravenosa. Se recolectaron muestras de bazo y / o médula ósea a 7 dpi y se sometieron a citometría de flujo, mientras que las muestras de plasma se utilizaron para ELISA.

Citometría de flujo

La médula ósea y los esplenocitos (0,5 & # x020131,0 & # x000d7 10 6 células) se tiñeron durante 1 hora a 4 & # x000b0C con sobrenadante de hibridoma de MAb34, que reacciona con la proteína Glyco-Gag de superficie de FV (35, 37). Las células se lavaron una vez, luego se tiñeron conjuntamente con IgG2b anti-ratón de cabra conjugado con APC (Columbia Biosciences). Otros anticuerpos utilizados para teñir conjuntamente las células incluyeron Ter119-PE (TER119), CD4-PE (RM4-5), CD8-FITC (53-6.7), GL7-FITC (Ly-77), CD138-PE (281- 2), Gr1-PE (RB6-8C5), CD11b-PE (M1 / 70) (BD Biosciences) IgD-PE (11 & # x0201326c.2a), CD19-PerCP-Cy5.5 (6D5), CD3-PerCP- Cy5.5 (17A2) (Biolegend) y B220-FITC (RA3.6B2), CD11c-FITC (N418), IgM-FITC (II / 41) (eBioscience). Se incluyeron los controles de isotipo correspondientes para la construcción de puertas. Estos anticuerpos se incubaron con las células durante 30 min a 4 ° C. Las muestras se lavaron 3x en tampón FACS (PBS + FBS al 2%), se fijaron con paraformaldehído al 0,5% en PBS y se analizaron en un citómetro de flujo FACScalibur II (Becton Dickinson) con recogida de 80.000 eventos por muestra. Las subpoblaciones de células se analizaron usando Flowjo (TreeStar, Inc).

Medición de los niveles de inmunoglobulina.

Los niveles de IgA, IgG, IgM, IgG1, IgG2b e IgG3 totales se midieron utilizando un kit ELISA comercial (ICL). Los niveles de estas inmunoglobulinas se calcularon usando una curva estándar en placa.


Discusión

Los resultados de este estudio revelaron aspectos previamente desconocidos de la inmunidad tumoral humoral después de un análisis inmunogenómico a gran escala de células B que infiltran el tumor en una gran cohorte de casos clínicos de GC. Encontramos que los complejos de RNP focales relacionados con la adhesión son antígenos humorales principales comunes en microambientes tumorales (Fig.7), la mayoría de los cuales también son objetivos comunes de enfermedades autoinmunes como LES, AR, MG, MS, PBC y SS (Tabla 1 ). Nuestros datos no solo aclararon un fenómeno general de inmunidad humoral en cánceres humanos, sino que también propusieron un hipotético nuevo eje de autoinmunidad, ambos directamente vinculados por el complejo RNP en la maquinaria de adhesión focal. También es de destacar que los antígenos proteicos identificados no son "neoantígenos" específicos de cada caso sino que son proteínas celulares comunes, por lo tanto, estos antígenos proteicos humorales se comparten comúnmente entre una amplia variedad de neoplasias malignas independientemente de sus perfiles de mutación somática.

Las maquinarias de adhesión focal complejadas con ribonucleoproteínas y moléculas de ARN son antígenos humorales frecuentes en entornos tumorales. Este estudio sugirió el tráfico específico de secuencia de moléculas de ARN a sitios focales de adhesión en células cancerosas. Dichos complejos de adhesión focal se exponen ocasionalmente al exterior de las células cancerosas (punta de flecha roja) y / o pueden descomponerse y depositarse en entornos estromales necróticos del cáncer (RNP grises), por lo que se considera que desencadenan y expanden la inmunidad de las células B en microambientes cancerosos. . TLR, receptores tipo Toll RNP, ribonucleoproteínas.

Este intrigante enriquecimiento de los antígenos de la proteína humoral en las RNP del complejo de adhesión focal puede indicar la presencia de una vía de señalización que subyace a la expansión dominante de las células B en entornos tumorales. Es bien conocido que la inmunidad humoral puede ser activada y / o mejorada por el eje de señalización de TLR en las células B 25,26. TLR3 y TLR7 / 8, por ejemplo, reconocen moléculas de ribonucleótidos, como dsRNA y / o ssRNA 27 para inducir señales de activación en las células B unidas a antígenos para que proliferen en situaciones en las que sus antígenos proteicos existen como formas complejadas con ribonucleótidos, en otras palabras, como RNPs 25,26. Este hecho es compatible con nuestro hallazgo del enriquecimiento de antígenos tumorales humorales en los RNP relacionados con la adhesión focal en el sentido de que, una vez que los RNP del antígeno se unieron y se engulleron en las células B, esas células B se activan de forma autónoma mediante señales endógenas aguas abajo de TLR, lo que resulta en la expansión dominante de las células B en los microambientes tumorales (Fig. 7). Es necesario confirmar esta hipótesis mediante una mayor experimentación.

El experimento FAK-RIP dirigido al complejo de adhesión focal endógeno confirmó además el enriquecimiento de ARN en los sitios de adhesión focal (Fig. 5 y Fig. 8 complementaria). Informes anteriores también mostraron el enriquecimiento de ARNm / ribosomas en adherencias focales y estructuras de lamelipodio 30,31,32 sin embargo, nuestros datos que muestran un enriquecimiento sesgado de ARN específicos indicaron además que el complejo FAK juega un papel como carga de ARN que transporta ARN específicos tales como aquellos con un motivo CAGCCC, por ejemplo, a la maquinaria de adhesión focal (Fig. 5 y Fig. 8 complementaria). Aunque no es estadísticamente seguro, el análisis de enriquecimiento de GO indicó que algunos de los ARNm enriquecidos con FAK-RIP se clasificaron como genes relacionados con RhoGEF, familias de Kinesina y proteínas de la membrana del endosoma / lisosoma (Datos suplementarios 7), lo que sugiere el “ARNm correcto para el derecho place ”teoría del transporte de ARNm por el complejo FAK, en el que los ARNm requeridos se transportan específicamente a las ubicaciones requeridas de los compartimentos celulares.Recientemente se han reportado distribuciones celulares sesgadas relacionadas con la función de ARN y transporte de ARN específico de secuencia 33,34 y un informe también sugirió la unión específica de secuencia de Ago2 y motivo CCAGCC en ARNm 35, todos los cuales apoyan nuestra hipótesis de ARN específico -Interacción de proteínas en el complejo de adhesión focal.

Una pregunta importante es por qué el complejo de adhesión focal es el antígeno humoral principal y común en el entorno tumoral. La inmunocitoquímica con y sin permeabilización (Fig. 6a-e) reveló que, al menos en entornos in vitro, los complejos de adhesión focal-RNP están expuestos al exterior de las membranas de las células cancerosas en algunas ocasiones. Aunque es técnicamente difícil verificar este fenómeno en muestras de cáncer humano in vivo, la evaluación inmunohistoquímica también sugirió que los complejos de adhesión focal-RNP podrían estar expuestos a las superficies externas de las células cancerosas (Fig. 9 complementaria). En una nota diferente, el movimiento celular se produce a través de la regulación sincronizada paso a paso de la maduración de la adhesión focal y las protuberancias del lamelipodio 36,37. Por tanto, se plantea la hipótesis de que las protuberancias celulares y / o los sitios de adhesión focal inmaduros son físicamente frágiles en entornos de cáncer in vivo en los que el tráfico de células y los obstáculos físicos de la matriz estromal pueden interferir con la invasión de las células cancerosas. En el contexto de los movimientos celulares activos en los microambientes del cáncer fibroso, la maquinaria de adhesión focal inmadura, hipotéticamente frágil, puede romperse físicamente o dejarse en la matriz. Esas estructuras rotas y desnudas de la maquinaria de adhesión celular pueden ser dirigidas directamente por las células B, por lo que la inmunidad humoral contra los complejos de adhesión focal-RNP domina con frecuencia en los GC. Las observaciones inmunohistoquímicas de FAK y los antígenos RNP relacionados en microambientes necróticos de cáncer de casos clínicos de GC sugirieron que tales complejos FAK rotos y desnudos pueden depositarse en los tejidos del estroma del cáncer (Fig.10 complementaria), aunque se requieren más experimentos para confirmar esta conclusión. Es importante destacar que observamos que dichos complejos de adhesión focal-RNP también se detectaron entre otros tipos de neoplasias malignas humanas como los cánceres de pulmón, colorrectal y de páncreas (Figura 5 y Figuras complementarias 5 y 6), lo que implica que la inmunidad humoral contra la adhesión focal- Los complejos de RNP también dominarían en varios entornos de cáncer en múltiples órganos. Debe subrayarse que los antígenos de RNP relacionados con la adhesión focal expuestos en las células cancerosas viables se dirigen directamente a los anticuerpos secretados. Las funciones biológicas directas de los anticuerpos humanos reconstruidos, cuando se aplicaron a líneas celulares de cáncer in vitro, no eran obvias (Fig.11 complementaria), sin embargo, se reveló que las cantidades de antígenos expuestos aumentaron cuando se cultivaron en condiciones más duras o con un agente quimioterapéutico ( Fig.11 complementaria). Con el éxito clínico del tratamiento del linfoma a través de activaciones combinadas de fagocitosis celular y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) utilizando anticuerpo anti-CD47 y Rituximab 38 dirigido a tumores, las investigaciones del potencial terapéutico de los anticuerpos RNP de adhesión anti-focal contra neoplasias son científicamente justificado.

La mayoría de los antígenos proteicos identificados en este estudio también son objetivos frecuentes de diversas enfermedades autoinmunes (Tabla 1). Hasta donde sabemos, aún no se han investigado las características bioquímicas y / o funcionales comunes de los autoantígenos en las enfermedades autoinmunes. Nuestros hallazgos sugieren que los complejos de adhesión focal-RNP que se revelan aquí como objetivos frecuentes y comunes de la inmunidad humoral en los tumores también son los desencadenantes generales de las enfermedades autoinmunes. Aproximadamente el 14-25% de los pacientes con cáncer de pulmón tienen trastornos de tipo autoinmunitario 39 y una revisión de la literatura también encontró asociaciones estadísticamente significativas en la co-ocurrencia de varias neoplasias malignas y enfermedades autoinmunes como LES, CBP, EM y MG 40. Además, un estudio de caso informó que los síntomas del LES y la nefritis lúpica mejoraron mediante la resección quirúrgica del tumor 41, lo que respalda clínicamente el vínculo directo entre la inmunidad al cáncer y la autoinmunidad a través de un eje similar de antígenos diana. Nuestros datos demuestran que estos principales antígenos comunes pueden ser RNP relacionados con la adhesión focal. Este vínculo plantea una hipótesis biológica y clínicamente interesante que propone la existencia de una categoría de enfermedad de "enfermedades autoinmunes focales relacionadas con la adhesión". Investigaciones precisas de las historias clínicas de los pacientes (Datos suplementarios 1) revelaron que los casos de CG en los que se descubrieron los antígenos de RNP relacionados con la adhesión focal no tenían enfermedades autoinmunes mayores clínicamente reconocibles 40 antes del desarrollo de CG. Por lo tanto, se consideró que las emergencias de los anticuerpos RNP focales relacionados con la adhesión se desencadenaron por reacciones humorales a los cánceres, que no reflejan estados autoinmunes preexistentes.

En resumen, el análisis inmunogenómico detallado a gran escala de los repertorios de células B que infiltran el tumor en los casos clínicos de GC identificó que las RNP relacionadas con la adhesión focal son antígenos humorales principales y comunes en los tumores. La inmunidad humoral en entornos tumorales se dirige a compartimentos celulares fundamentales esenciales para la integridad citoesquelética y la invasión celular, lo que arroja luz sobre la caja negra de la inmunidad humoral en los tumores y, con suerte, apunta a una idea científica para desarrollar inmunoterapias futuras. Una investigación más enfocada del mecanismo molecular, así como la aplicabilidad clínica de los hallazgos de este estudio, allanarán el camino en la lucha contra los cánceres intratables para las inmunoterapias actualmente disponibles.


Modelo para la producción de mutaciones tanto en SHM como en CSR

La reciente explosión de información sobre moléculas responsables de SHM y CSR descrita anteriormente ha llevado a un modelo general (Poltoratsky et al.2000 Petersen-Mahrt et al.2002) que incorpora los hallazgos descritos anteriormente y es utilizado por muchos en el campo para explicar el inicio de ambos procesos (Fig. 3). La AID solo se expresa en células B centroblastos, de ahí la restricción de SHM y CSR a esta etapa de diferenciación de células B, y la regulación de estos procesos depende de la activación transcripcional de AID. La AID recién sintetizada puede asociarse con otras moléculas o sufrir modificaciones postraduccionales como la fosforilación para que pueda ser transportada desde el citoplasma al núcleo. Aunque la AID tiene un motivo de localización nuclear bipartito putativo, todavía no está claro si esto es funcional y suficiente, así como si la AID necesita ser acompañada en el núcleo. Una vez que se transporta al núcleo, AID interactúa con ssDNA en las regiones V y S y desamina dC a dU para producir desajustes G-U. Como se muestra en el diagrama en la Figura 3, la dU creada por AID puede replicarse posteriormente para producir una mutación C-to-T o una mutación G-to-A en la otra hebra (fase I A) o ser eliminada por UNG para crear un sitio abásico. Posteriormente, el sitio abásico puede convertirse en una muesca monocatenaria mediante AP-endonucleasa y luego repararse mediante reparación por escisión de bases sin generar mutaciones, o puede evitarse mediante ADN polimerasa propensa a errores para generar mutaciones (fase IB), reconocido por MSH2-MSH6, y luego escindido y reemplazado por resíntesis con polimerasas propensas a errores que crearán mutaciones adicionales, incluidas mutaciones en pares de bases AT (fase II). No está claro si estos procesos compiten entre sí de forma aleatoria o si están coordinados y regulados por otros factores, como los niveles de expresión de las proteínas relevantes mediados por el ciclo celular. Además, existe alguna evidencia indirecta de que la AID introduce muchas más lesiones de las que finalmente se fijan como mutaciones puntuales en la región V y que muchas de las mutaciones inducidas por AID se reparan mediante recombinación homóloga en S y G tardíos.2 (Sale y Neuberger 1998 Faili et al. 2002b). Estudios recientes de SHM en una línea celular de linfoma de Burkitt también han invocado un papel para la recombinación homóloga (Zan et al. 2003).

Modelo de hipermutación somática. Durante la transcripción mediada por la ARN polimerasa (RNAP, óvalo naranja), AID (óvalo amarillo) y cofactores (óvalos azules) desaminan las citosinas (C) en el ADN monocatenario de la burbuja de transcripción para generar uracilo (U). El resultado de esta reacción es un desajuste G-U que se puede resolver de la siguiente manera: (fase I, A) Los desajustes de G-U experimentan una replicación del ADN y dan como resultado una mutación de C-a-T. (B) UNG elimina el uracilo y el sitio abásico resultante se procesa mediante la reparación por escisión de la base sin errores o se replica en cualquier base. (Fase II) Las proteínas de reparación de desajustes (MMR) MSH2 y MSH6 (óvalos azules y rojos) se unen a desajustes G-U o desajustes G-abásicos y posteriormente reclutan proteínas MMR adicionales, así como polimerasas propensas a errores para generar mutaciones en pares de bases A / T.

Después de que se introduce dU en las regiones S, existe el requisito adicional de roturas de ADN de doble hebra para permitir la recombinación de S. Las rupturas del ADN de doble hebra en la región S pueden estar escalonadas y podrían ser el resultado de muchas rupturas monocatenarias resultantes de las actividades de AID, UNG, MMR y AP-endonucleasa, o pueden ser creadas por algunos aún no identificados. mecanismo. Una vez que las roturas del ADN de doble hebra se crean y procesan en la región S, pueden repararse mediante el mecanismo NHEJ o pueden resolverse mediante otros mecanismos de reparación del ADN, como la recombinación homóloga. Si bien este modelo para las mutaciones que ocurren en las regiones V y S explica muchas de las observaciones descritas en las secciones anteriores, está incompleto e incluso podría ser incorrecto porque todavía hay muchas preguntas sin resolver y temas controvertidos, algunos de los cuales ahora serán tratados. discutido.


Protocolo de recuperación de antígenos IHC

Conozca los dos métodos de recuperación de antígenos: mediada por calor (también conocida como recuperación de epítopos inducida por calor o HIER) y enzimática.

La mayoría de los tejidos fijados con formalina requieren un paso de recuperación de antígeno antes de la tinción inmunohistoquímica. Los puentes de metileno formados durante la fijación entrecruzan las proteínas y enmascaran los sitios antigénicos. Los métodos de recuperación de antígenos rompen estos puentes de metileno y exponen los sitios antigénicos, lo que permite que los anticuerpos se unan. Los dos métodos para la recuperación de antígenos son la recuperación de epítopos inducida por calor (HIER) y la recuperación enzimática.

La recuperación enzimática a veces puede dañar la morfología de la sección, por lo que es necesario probar la concentración y el tiempo de tratamiento.

La recuperación de epítopos inducida por el calor se realiza con mayor frecuencia utilizando una olla a presión, un microondas o una vaporera para verduras. Algunos laboratorios usan un baño de agua a 60 ° C e incuban los portaobjetos en la solución de recuperación durante la noche. Esto es útil cuando se trabaja con secciones de tejido que se caen del portaobjetos cuando se calientan a temperaturas más altas, en particular huesos, cartílagos y piel.

A menos que el método de recuperación del antígeno se indique en la hoja de datos del anticuerpo, el método óptimo para cada antígeno debe encontrarse experimentalmente. Esto se aplica también a la elección del tampón utilizado para la recuperación mediada por calor. Recomendamos probar varios métodos para encontrar el método de recuperación que proporcione una tinción óptima.

Búferes convenientes para resultados confiables

Para obtener resultados sólidos con la recuperación de antígenos mediada por calor, recomendamos nuestros tampones de recuperación de antígenos pre-formulados. Estos incluyen los tres tampones más utilizados: elija entre nuestro kit de tampón de citrato, el kit de tampón Tris-EDTA o el kit de tampón EDTA o utilice nuestro kit de tampón Tris.

También ofrecemos un kit de reactivo de recuperación de antígeno mediado por calor universal (utilizado con nuestro clon 28-8 de PD-L1 líder) que es compatible con la mayoría de los anticuerpos y elimina la necesidad de múltiples tampones.

Para la recuperación de antígenos enzimáticos, recomendamos nuestro kit de solución de tripsina. También ofrecemos un kit de solución de pepsina y un kit de solución de proteinasa K.

Alternativamente, puede preparar sus propios tampones y soluciones y utilizar los mismos métodos recomendados a continuación.

Soluciones tampón para la recuperación de epítopos inducida por calor

Las siguientes soluciones son tres de los búferes más populares para HIER. En ausencia de la información de la hoja de datos, la elección del búfer de recuperación se realiza mejor mediante una prueba.

Tampón de citrato de sodio (citrato de sodio 10 mM, Tween 20 al 0,05%, pH 6,0)

  • Citrato trisódico (dihidrato) 2,94 g
  • Agua destilada 1 L
  • Mezclar para disolver. Ajuste el pH a 6.0 con HCl 1N.
  • Agregue 0.5 mL de Tween 20 y mezcle bien. Almacenar a temperatura ambiente durante 3 meses o
  • 4 ° C para un almacenamiento más prolongado

EDTA 1 mM, pH 8,0

  • EDTA 0,37 g
  • Agua destilada 1 L
  • Ajustar a pH 8.0 con NaOH
  • Almacenar a temperatura ambiente durante 3 meses.

Tampón Tris-EDTA (base Tris 10 mM, solución EDTA 1 mM, Tween 20 al 0,05%, pH 9,0)

  • Tris 1,21 g
  • EDTA 0,37 g
  • Agua destilada 1 L
  • Mezclar para disolver. Ajuste el pH a 9.0.
  • Agregue 0.5 mL de Tween 20 y mezcle bien. Almacenar a temperatura ambiente durante 3 meses oa 4 ° C para un almacenamiento más prolongado.

Métodos de recuperación de epítopos inducidos por el calor: olla a presión

Los portaobjetos deben colocarse en una rejilla de metal para este procedimiento.

Materiales y reactivos

  • Olla a presión doméstica de acero inoxidable
  • Plato caliente
  • Recipiente con rejilla para portaobjetos para contener aproximadamente 400-500 ml
  • Tampón de recuperación de antígeno (Tris / EDTA pH 9,0, citrato de sodio pH 6,0 u otro)

Se recomienda un experimento de control para optimizar el tiempo de recuperación, donde los portaobjetos de la misma sección de tejido se recuperan durante 1, 2, 3, 4 y 5 minutos antes de ser teñidos inmunohistoquímicamente.

  1. Agregue el tampón de recuperación de antígeno apropiado a la olla a presión. Coloque la olla a presión sobre la placa de cocción y enciéndala a máxima potencia. No asegure la tapa de la olla a presión en este punto, simplemente colóquela encima. Mientras espera a que hierva la olla a presión, desparafinar y rehidratar las secciones.
  2. Una vez hirviendo, transfiera los portaobjetos del agua del grifo a la olla a presión.

Esto es para permitir que los portaobjetos se enfríen lo suficiente para que puedan manipularse y para permitir que el sitio antigénico se vuelva a formar después de haber sido expuestos a altas temperaturas.

Métodos de recuperación de epítopos inducidos por calor: microondas

Se desaconseja el uso de un microondas doméstico. Los puntos calientes y fríos son comunes, lo que lleva a una recuperación desigual del antígeno. Los tiempos de recuperación de antígenos suelen ser más largos debido a la ausencia de un entorno presurizado, lo que casi siempre conduce a la disociación de la sección. Un microondas científico es más apropiado. La mayoría de las marcas tienen recipientes presurizados a bordo y pueden mantener la temperatura constante a 98 ° C para evitar la disociación de la sección.

Cuando se utiliza este método, es posible que el búfer se desborde y una gran cantidad del búfer de recuperación se evapore. Asegúrese de observar el nivel de tampón del recipiente de portaobjetos y agregue más tampón si es necesario. No permita que los portaobjetos se sequen.

Los portaobjetos deben colocarse en una rejilla y recipiente de plástico para este procedimiento. Las gradillas y recipientes de tinción de vidrio para histología estándar se agrietarán cuando se calienten.

Materiales y reactivos

  • Microondas científico o doméstico (850 W)
  • Recipiente apto para microondas con rejilla para portaobjetos para aproximadamente 400-500 ml o frasco Coplins
  • Tampón de recuperación de antígeno (p. Ej., Tris / EDTA pH 9,0, citrato de sodio pH 6,0, etc.)

    Desparafinar y rehidratar los cortes.

Métodos de recuperación de epítopos inducidos por el calor: vaporera de verduras

Muchos laboratorios utilizan un vaporizador de verduras o una olla arrocera para la recuperación de antígenos mediada por calor. El procedimiento es similar al microondas en que mantiene la temperatura del tampón a 100 ° C, pero sin la ebullición vigorosa del método de microondas. Este método puede adaptarse a un baño de agua a 100 ° C en lugar del vaporizador.

Los portaobjetos deben colocarse en una rejilla y recipiente de plástico o metal para este procedimiento. Las gradillas y recipientes de tinción de vidrio para histología estándar se agrietarán cuando se calienten.

Materiales y reactivos

  • Vaporera de verduras
  • Recipiente con rejilla para portaobjetos para contener aproximadamente 400 a 500 ml (o 250 ml si se utilizan recipientes Tissue-Tek)
  • Tampón de recuperación de antígeno (p. Ej., Tris / EDTA pH 9,0, citrato de sodio pH 6,0)

  1. Desparafinar y rehidratar las secciones como se indicó anteriormente.
  2. Configure la vaporera de verduras de acuerdo con las instrucciones del fabricante y precaliente.

Recuperación de antígenos enzimáticos

La enzima a utilizar se indicará en la hoja de datos del anticuerpo. De lo contrario, la tripsina es útil para una amplia gama de antígenos que requieren recuperación después de la fijación con formalina / PFA.

Existen al menos dos métodos para aplicar la solución enzimática al tejido: pipetear directamente la solución sobre el tejido del portaobjetos o colocar una rejilla de portaobjetos en un recipiente de solución enzimática. El primer método utiliza menos reactivo, pero dado que cada portaobjetos debe manipularse individualmente, el tiempo de incubación debe controlarse cuidadosamente para cada portaobjetos para garantizar que todos los portaobjetos reciban el mismo tratamiento. Por esta razón, es más fácil tratar grandes lotes de portaobjetos sumergiéndolos en un recipiente con solución enzimática. Si utiliza un sistema de tinción automatizado (por ejemplo, Ventana), consulte al fabricante para obtener un protocolo de recuperación enzimático adecuado.

Método de pipeteo: materiales y reactivos

  • Incubadora a 37 ° C
  • Cámara humidificada (ya sea la propia incubadora o un recipiente con una toalla de papel húmeda)
  • Dos contenedores de rack de diapositivas de TBS con rack de diapositivas
  • Solución de recuperación de antígeno enzimático (para tripsina, ver más abajo)

Solución madre de tripsina (0,5% en agua destilada)

  • Tripsina 50 mg
  • Agua destilada 10 mL
  • Mezclar para disolver, almacenar a -20ºC

Solución madre de cloruro de calcio (1%)

  • Cloruro de calcio 0,1 g
  • Agua destilada 10 mL
  • Mezclar bien y conservar a 4ºC.

Solución de trabajo de tripsina (0,05%)

  • Solución madre de tripsina (0,5%) 1 ml
  • Solución madre de cloruro de calcio 1% 1 mL
  • Agua destilada 8 mL
  • Ajuste el pH a 7,8 con NaOH 1N. almacenar a 4ºC durante un mes o -20ºC para almacenamiento a largo plazo

Método de pipeteo: método

  1. Preparar la solución de tripsina y precalentar a 37 ° C. Seque con cuidado el exceso de agua alrededor de la sección de tejido y pipetee la solución de enzima (generalmente, serán suficientes 50-100 μL) en la sección. Puede ser necesario esparcir la solución alrededor de la sección con la punta de la pipeta, tenga cuidado de no dañar el tejido.
  2. Coloque los portaobjetos en un recipiente humidificado y luego en la incubadora a 37 ° C. Evite colocar los portaobjetos directamente en los estantes de la incubadora, ya que habrá variaciones de temperatura que podrían afectar la intensidad de la tinción. Idealmente, el recipiente que contiene los portaobjetos se precalienta en la incubadora.
  3. Después de 10 a 20 minutos (esto deberá optimizarse), retire los portaobjetos de la incubadora y transfiéralos a una rejilla en un recipiente con agua del grifo. Enjuague con agua corriente durante 3 min.
  4. Continúe con el protocolo de tinción inmunohistoquímica.

Método de inmersión: materiales y reactivos

  • Baño de agua a 37 ° C
  • Estantes deslizantes y contenedores de estantes deslizantes
  • Solución de recuperación de antígeno enzimático (para tripsina, consulte el método de pipeteo de recuperación enzimática)

Método de inmersión: método

Asegúrese de leer la literatura del fabricante para la enzima que elija, ya que algunas enzimas requieren tampones y cofactores específicos para su actividad.

    Configure el baño de agua a la temperatura óptima para la enzima que está utilizando. Agregue agua ultrapura a dos recipientes que puedan contener rejillas de diapositivas. Coloque los recipientes en el baño de agua para que se calienten.

También puede acceder a nuestros protocolos más populares directamente desde su teléfono con la aplicación Abcam, que cuenta con protocolos, soporte científico y un conjunto de herramientas útiles que son útiles para cualquier científico de laboratorio. Aprende más.


El significado de la detección de anticuerpos irregulares

El cribado irregular de anticuerpos se refiere al examen de todos los anticuerpos distintos de los del sistema de grupo sanguíneo ABO humano. La detección de anticuerpos irregulares es fundamental para garantizar una transfusión de sangre segura y reducir las reacciones a la transfusión en los receptores de sangre. Debido a su importancia, se recomienda realizar un cribado de anticuerpos irregulares como parte del protocolo estándar, especialmente en mujeres embarazadas. Sin embargo, en algunas regiones del mundo, especialmente en los países en desarrollo, la detección de anticuerpos irregulares no forma parte del protocolo de detección estándar. Esto puede aumentar el riesgo de reacciones a las transfusiones de sangre, que a veces pueden ser graves.

Para comprender qué es la detección irregular de anticuerpos, primero es necesario comprender qué es el sistema de grupo sanguíneo ABO.

Sistema de grupo sanguíneo ABO

¿Conoces tu tipo de sangre? Actualmente, es muy fácil controlar su tipo de sangre en el hospital. Pero alguna vez se pensó que todos los seres humanos tenían sangre similar, y muchas personas estaban muriendo a causa de las transfusiones de sangre, y los médicos no sabían por qué. No fue hasta 1901 que un científico austriaco llamado Karl Landsteiner encontró grupos sanguíneos. Hasta la fecha, está bien establecido que hay cuatro tipos de sangre principales entre los seres humanos, a saber, A, B, O y AB, que se denominan colectivamente sistema de grupo sanguíneo ABO. Un tipo de sangre puede ser incompatible con otro, y esta incompatibilidad es la razón de las a menudo trágicas consecuencias de las transfusiones de sangre anteriores.

Un cuerpo adulto normalmente contiene 5-6 litros de sangre. La sangre es un tejido altamente especializado compuesto por varios miles de tipos de componentes, que incluyen diversas células como glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas, proteínas, sales, etc. Normalmente, el 55% del volumen de sangre es plasma, un líquido compuesto principalmente de proteínas. y sales. Los grupos sanguíneos ABO se clasifican según las propiedades de los glóbulos rojos. De acuerdo con la presencia o ausencia de los antígenos A y B en la superficie de los glóbulos rojos, una persona puede tener sangre tipo A, tipo B, tipo O o tipo AB.

* La sangre tipo A tiene antígeno A en los glóbulos rojos y anticuerpos anti-B en el plasma.

* La sangre tipo B tiene antígeno B en los glóbulos rojos y anticuerpo anti-A en el plasma.

* La sangre tipo O no tiene antígeno A ni antígeno B en los glóbulos rojos, y tiene anticuerpos anti-A y anti-B en el plasma.

* La sangre tipo AB tiene antígeno A y antígeno B en los glóbulos rojos y no tiene anticuerpos anti-A ni anti-B en el plasma.

La figura 1 a continuación muestra las propiedades de los glóbulos rojos y el plasma de cada tipo de sangre con mayor claridad.

Fig.1 Cuatro tipos de sangre principales

Antígeno (s) en los glóbulos rojos

Anticuerpos en el plasma

Anti-A y Anti-B pueden unirse a los glóbulos rojos con los antígenos correspondientes y activar la cascada del complemento, lo que resulta en hemólisis. Por ejemplo, un receptor con sangre tipo A no debe recibir una transfusión de glóbulos rojos de un donante con sangre tipo B o AB, o se producirán reacciones transfusionales nocivas. Por lo tanto, el análisis de sangre ABO es una parte esencial del protocolo estándar antes de la transfusión de sangre, ya que ayuda a evitar la hemólisis por incompatibilidad del grupo sanguíneo ABO.

El descubrimiento del sistema de grupo sanguíneo ABO ha reducido en gran medida las reacciones a las transfusiones y ha mejorado la seguridad de las transfusiones de sangre. Pero otros factores, especialmente los anticuerpos irregulares, también pueden ser la causa de reacciones clínicas transfusionales.

Los anticuerpos regulares y los anticuerpos irregulares son los dos grupos principales de anticuerpos clasificados aproximadamente según el momento y el evento desencadenante de la producción de anticuerpos.

Los anticuerpos regulares son aquellos dirigidos contra los antígenos A y B del grupo sanguíneo ABO. Su producción ocurre muy temprano en la vida. Los transfusionistas de sangre suelen aludir a los anticuerpos regulares como anticuerpos naturales.

Los anticuerpos irregulares se refieren a todos los anticuerpos distintos de los del sistema de grupo sanguíneo ABO. Estos anticuerpos no existen en condiciones normales, pero pueden producirse como resultado de ciertas afecciones como transfusiones de sangre, inyecciones, incompatibilidad de grupos sanguíneos maternos e infantiles en el embarazo e inmunoestimulantes de productos sanguíneos o algunos estímulos no percibidos.

Como medida terapéutica importante, la transfusión de sangre se utiliza a menudo para rescatar a los pacientes con hemorragia aguda. Además, la transfusión de sangre tiene importantes efectos terapéuticos para los pacientes con anemia crónica, enfermedades de consumo crónico, infecciones graves y enfermedades hemorrágicas.

Con el desarrollo de la tecnología de transfusión de sangre, la incidencia de reacciones hemolíticas rápidas causadas por la incompatibilidad del grupo sanguíneo ABO ha disminuido significativamente. Los datos disponibles muestran que, en la actualidad, los anticuerpos irregulares son la principal causa de reacciones clínicas transfusionales. Además, los anticuerpos irregulares pueden desencadenar una enfermedad hemolítica en los recién nacidos, plantear dificultades en la identificación del tipo de sangre y dar lugar a casos clínicos de compatibilidad cruzada cuestionables. Además, los anticuerpos irregulares también están asociados con el aborto y la muerte fetal. Por lo tanto, la detección de anticuerpos irregulares es muy importante.

El cribado irregular de anticuerpos antes de la transfusión de sangre, especialmente para los receptores en departamentos de alto riesgo, puede reducir eficazmente la incidencia de reacciones hemolíticas después de la transfusión de sangre, lo que garantiza la seguridad de la transfusión de sangre clínica. En los Estados Unidos, Japón, Australia y muchos otros países, la detección irregular de anticuerpos se ha convertido en parte del protocolo estándar antes de la transfusión de sangre. Sin embargo, en algunos países en desarrollo, la detección irregular de anticuerpos a menudo no se realiza o solo se realiza en algunos pacientes. Esto aumenta el riesgo de reacciones transfusionales nocivas. Si los anticuerpos irregulares están presentes en la sangre de un receptor o donante, pueden ocurrir reacciones transfusionales agudas o de inicio tardío e incluso causar eventos potencialmente mortales.

La detección de anticuerpos se realiza a menudo mediante la realización de una prueba de Coombs, que también se conoce como prueba de antiglobulina o detección de anticuerpos de glóbulos rojos. Hay dos tipos de prueba de Coombs: directa e indirecta, como se muestra en la Fig.2.

(Por ningún autor legible por máquina proporcionado. A. Rad

commonswiki asumido (basado en reclamos de derechos de autor). - No se proporciona una fuente legible por máquina. Trabajo propio asumido (basado en reclamos de derechos de autor)., CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=517391.)

Ambas pruebas de Coombs se basan en la unión de anticuerpos antihumanos a anticuerpos humanos (comúnmente IgG o IgM). Los anticuerpos antihumanos se generan en animales y reaccionarán con los anticuerpos humanos dirigidos contra los glóbulos rojos. La prueba de Coombs implica el uso de una pequeña muestra de sangre del receptor o donante y se puede realizar en un pequeño tubo de vidrio, en un portaobjetos de vidrio o en una tira reactiva. Si se produce la aglutinación de glóbulos rojos, es un resultado positivo. Si no se produce aglutinación, es un resultado negativo.

La prueba de Coombs analiza su sangre en busca de anticuerpos que ataquen a los glóbulos rojos. Si tiene anticuerpos irregulares en su plasma, dará positivo.

En un estudio de 2011 (Xianjun Ma et al.), Los científicos examinaron anticuerpos irregulares en receptores de transfusiones de sangre de China mediante la prueba de Coombs. Entre los 29.236 pacientes examinados, 138 (0,47%) dieron positivo por anticuerpos irregulares. La especificidad de estos anticuerpos irregulares fue principalmente anti-M, anti-D, anti-C y anti-E. La tasa positiva de anticuerpos irregulares en las mujeres fue más alta que en los hombres y la tasa positiva en las mujeres embarazadas fue más alta que en las mujeres no embarazadas. Estas diferencias pueden deberse a que se pueden desarrollar anticuerpos irregulares durante el embarazo. Además, los científicos observaron una reducción sustancial en el número de reacciones a las transfusiones después de introducir la detección de anticuerpos irregulares en el hospital. Estos hallazgos enfatizan la necesidad de realizar pruebas de detección de anticuerpos irregulares como parte del protocolo estándar, particularmente en mujeres embarazadas. Además, las personas que dan positivo en la prueba de anticuerpos irregulares deben someterse a pruebas de detección adicionales para identificar subtipos de anticuerpos a fin de reducir las reacciones a las transfusiones de sangre y mejorar la seguridad de las transfusiones de sangre.

En resumen, la detección de anticuerpos irregular es el examen de todos los anticuerpos no ABO en la sangre. Este examen es muy importante porque ayuda a reducir las reacciones a las transfusiones de sangre. El simple hecho de analizar los tipos de sangre ABO no es suficiente para cumplir con los requisitos de seguridad para las transfusiones de sangre. La detección de anticuerpos irregulares es un complemento de la identificación de sangre ABO para garantizar una transfusión de sangre segura.

[1] Carel Jan van Oss, Carta al editor: Anticuerpos "naturales" versus anticuerpos regulares, El diario de proteínas (2004).

[2] Xianjun Ma et al, Detección de anticuerpos irregulares en la región de Shandong e impacto clínico en la transfusión de sangre: una revisión de un caso de 2008 a 2010, Revista de tecnología de la información de convergencia (2011).

[3] RONG Shiqin, Valor clínico de la detección irregular de anticuerpos en la transfusión de sangre segura, Diario médico de Youjian (2013).

[4] Chen Yong et al, Importancia de la detección irregular de anticuerpos antes de la transfusión de sangre en la transfusión de sangre clínica, Int J Lab Med (2013).

[5] LUO Jian-hua, Análisis clínico de detección irregular de anticuerpos y seguridad clínica de la transfusión de sangre en receptores de sangre, Revista de Medicina Clínica y Experimental (2013).

[6] MA Xianjun et al, Importancia de la detección irregular de anticuerpos de los receptores en transfusiones clínicas seguras, Revista de hematología clínica (2009).

[7] Xia Hefeng, Importancia clínica de la detección de anticuerpos irregulares antes de la transfusión de sangre, Jiangsu Med J (2013).

[8] Xu Jixun, detección irregular de anticuerpos antes de la transfusión de sangre y seguridad de la transfusión de sangre clínica, Revista de hematología clínica (2010).


El sistema inmunológico y la inmunización

El medio ambiente contiene una amplia variedad de organismos potencialmente dañinos (patógenos), como bacterias, virus, hongos, protozoos y parásitos multicelulares, que causarán enfermedades si ingresan al cuerpo y se les permite multiplicarse. El cuerpo se protege a sí mismo a través de varios mecanismos de defensa para prevenir físicamente que los patógenos entren en el cuerpo o para matarlos si lo hacen.

El sistema inmunológico es un mecanismo de defensa extremadamente importante que puede identificar un organismo invasor y destruirlo. La inmunización previene las enfermedades al permitir que el cuerpo responda más rápidamente al ataque y mejore la respuesta inmune a un organismo en particular.

Cada patógeno tiene componentes distintivos únicos, conocidos como antígenos, que permiten al sistema inmunológico diferenciar entre lo "propio" (el cuerpo) y lo "no propio" (el material extraño). La primera vez que el sistema inmunológico ve un nuevo antígeno, necesita prepararse para destruirlo. Durante este tiempo, el patógeno puede multiplicarse y causar enfermedades. Sin embargo, si se vuelve a ver el mismo antígeno, el sistema inmunológico está preparado para confinar y destruir el organismo rápidamente. Esto se conoce como inmunidad adaptativa.

Las vacunas utilizan esta inmunidad y memoria adaptativas para exponer el cuerpo al antígeno sin causar enfermedad, de modo que cuando un patógeno vivo infecta el cuerpo, la respuesta es rápida y se evita que el patógeno cause la enfermedad. Dependiendo del tipo de organismo infeccioso, la respuesta requerida para eliminarlo varía. Por ejemplo, los virus se esconden dentro de las propias células del cuerpo en diferentes tejidos, como la garganta, el hígado y el sistema nervioso, y las bacterias pueden multiplicarse rápidamente dentro de los tejidos infectados.

Lineas de defensa

El cuerpo previene la infección a través de una serie de mecanismos específicos e inespecíficos que actúan solos o juntos. Las primeras líneas de defensa del cuerpo son las barreras externas que evitan la entrada de gérmenes. La más grande de todas es la piel, que actúa como una barrera física fuerte e impermeable y muy pocos organismos pueden penetrar la piel intacta. Existen otras barreras físicas y una variedad de defensas químicas. A continuación se ofrecen ejemplos de estas defensas no específicas:

  • Piel - una barrera física fuerte, como una pared impermeable
  • Moco - una trampa pegajosa secretada por todas las superficies internas del cuerpo que están directamente ligadas al exterior, también contiene anticuerpos y enzimas
  • Cilios - pelos microscópicos en las vías respiratorias que se mueven para expulsar los desechos y la mucosidad de los pulmones
  • Lisozima - una sustancia química (enzima) presente en las lágrimas y el moco que daña las bacterias
  • Fagocitos - varias células que recolectan y engullen desechos y organismos invasores, que forman parte del sistema de vigilancia para alertar al sistema inmunológico de un ataque
  • Bacterias comensales - bacterias en la piel y el intestino que compiten con bacterias potencialmente dañinas por espacio y nutrientes
  • Ácido - en el estómago y la orina, dificulta la supervivencia de los gérmenes
  • Fiebre - temperatura corporal elevada que hace que las condiciones sean desfavorables para que los patógenos sobrevivan

La respuesta inmune

Una respuesta inmune se desencadena cuando el sistema inmunológico recibe una alerta de que algo extraño ha entrado en el cuerpo. Los desencadenantes incluyen la liberación de sustancias químicas por las células dañadas y la inflamación, y cambios en el suministro de sangre a un área dañada que atraen a los glóbulos blancos.

Los glóbulos blancos destruyen la infección o transmiten mensajes químicos a otras partes del sistema inmunológico. A medida que la sangre y los fluidos tisulares circulan por el cuerpo, varios componentes del sistema inmunológico están continuamente investigando en busca de posibles fuentes de ataque o células anormales.

Antígenos y anticuerpos

Los antígenos suelen ser proteínas o polisacáridos (largas cadenas de moléculas de azúcar que forman la pared celular de ciertas bacterias). Un antígeno es una molécula que estimula una respuesta inmunitaria y a la que se unen los anticuerpos; de hecho, el nombre se deriva de "untibody generadores ". Cualquier organismo dado contiene varios antígenos diferentes. Los virus pueden contener desde tres antígenos hasta más de 100 como los virus del herpes y la viruela, mientras que los protozoos, los hongos y las bacterias son organismos más grandes y complejos y contienen de cientos a miles de antígenos.

Una respuesta inmune implica inicialmente la producción de anticuerpos que pueden unirse a un antígeno particular y la activación de glóbulos blancos específicos de antígeno.

Los anticuerpos (inmunoglobulinas Ig) son moléculas de proteína que se unen específicamente a una parte particular de un antígeno, el llamado epítopo o sitio antigénico. Se encuentran en la sangre y los fluidos de los tejidos, incluidas las secreciones de moco, la saliva y la leche materna. Hay cinco clases de anticuerpos: IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, que tienen una variedad de funciones. Pueden actuar como "banderas" para dirigir el sistema inmunológico hacia material extraño para su destrucción y formar parte de la respuesta inmune innata / humoral. Normalmente, los niveles bajos de anticuerpos circulan en los fluidos de los tejidos corporales. Sin embargo, cuando se activa una respuesta inmune, se producen mayores cantidades para atacar específicamente el material extraño.

La vacunación aumenta los niveles de anticuerpos circulantes contra un determinado antígeno. Los anticuerpos son producidos por un tipo de glóbulos blancos (linfocitos) llamados células B. Cada célula B solo puede producir anticuerpos contra un epítopo específico. Cuando se activa, una célula B se multiplicará para producir más clones capaces de secretar ese anticuerpo en particular. La clase de anticuerpo producido está determinada por otras células en el sistema inmunológico, esto se conoce como inmunidad mediada por células.

Respuesta primaria

Tras la exposición a un patógeno, el cuerpo intentará aislarlo y destruirlo. Los productos químicos liberados por la inflamación aumentan el flujo sanguíneo y atraen los glóbulos blancos al área de la infección. Las células especializadas, conocidas como fagocitos, engullen al objetivo y lo desmantelan. Estos fagocitos luego viajan a los ganglios linfáticos más cercanos donde "presentan" los antígenos a otras células del sistema inmunológico para inducir una respuesta más amplia y específica. Esta respuesta conduce a la producción de anticuerpos específicos de antígeno.

Los anticuerpos circulantes luego encuentran el organismo y se unen a sus antígenos de superficie. De esta forma se etiqueta como objetivo. Esta respuesta específica también se denomina respuesta inmunitaria adaptativa o mediada por células, ya que el sistema inmunológico se adapta para adaptarse al tipo de invasor.

Cuando el cuerpo se expone por primera vez a un antígeno, pasan varios días antes de que esta respuesta adaptativa se active. Tras la primera exposición a un patógeno, la actividad inmunológica aumenta, luego se estabiliza y cae. Dado que la primera, o primaria, respuesta inmune es lenta, no puede prevenir la enfermedad, aunque puede ayudar en la recuperación.

Una vez que se activan las células T y B específicas de antígeno (linfocitos), su número se expande y, después de una infección, algunos memoria las células permanecen dando como resultado memoria para los antígenos específicos. Esta memoria puede tardar algunos meses en desarrollarse por completo.

Respuesta secundaria

Durante exposiciones posteriores al mismo patógeno, el sistema inmunológico puede responder rápidamente y la actividad alcanza niveles más altos.

Las respuestas inmunitarias secundarias generalmente pueden prevenir la enfermedad, porque el patógeno se detecta, ataca y destruye antes de que aparezcan los síntomas. En general, los adultos responden más rápidamente a la infección que los niños. Pueden prevenir enfermedades o reducir la gravedad de la enfermedad mediante el montaje de una respuesta inmune rápida y fuerte a los antígenos que han experimentado previamente. Por el contrario, los niños no han experimentado tantos antígenos y tienen más probabilidades de enfermarse.

La memoria de la infección se refuerza y ​​los anticuerpos de larga duración permanecen en circulación. Algunas infecciones, como la varicela, inducen un recuerdo de la infección de por vida. Otras infecciones, como la influenza, varían de una temporada a otra hasta tal punto que ni siquiera un adulto puede adaptarse.

Vacunación

La vacunación utiliza esta respuesta secundaria al exponer el cuerpo a los antígenos de un patógeno en particular y activa el sistema inmunológico sin causar enfermedad.

La respuesta inicial a una vacuna es similar a la de la respuesta primaria tras la primera exposición a un patógeno, lenta y limitada. Las dosis posteriores de la vacuna actúan para estimular esta respuesta, lo que da como resultado la producción de anticuerpos y células de memoria de larga duración, como lo haría naturalmente después de infecciones posteriores.

El objetivo de las vacunas es preparar el cuerpo, de modo que cuando un individuo se expone al organismo causante de la enfermedad, su sistema inmunológico pueda responder rápidamente y con un alto nivel de actividad, destruyendo así el patógeno antes de que cause la enfermedad y reduzca la riesgo de contagio a otras personas.

Las vacunas varían en la forma en que estimulan el sistema inmunológico. Algunos brindan una respuesta más amplia que otros. Las vacunas influyen en la respuesta inmunitaria a través de la naturaleza de los antígenos que contienen, incluido el número y las características de los antígenos, o mediante la vía de administración, como la inyección oral, intramuscular o subcutánea. El uso de adyuvantes en las vacunas puede ayudar a determinar el tipo, la duración y la intensidad de la respuesta primaria y las características de la memoria específica del antígeno resultante.

Para la mayoría de las vacunas, es posible que se requiera más de una dosis para proporcionar una protección sostenida y duradera, para estar completamente inmunizado.

Tipos de inmunización

Inmunización activa - el cuerpo genera su propia respuesta para protegerse contra la infección a través de células y anticuerpos especializados, estimulados por las vacunas. La protección completa requiere tiempo para desarrollarse, pero es duradera.

Inmunización pasiva - Los anticuerpos prefabricados se transmiten directamente a la persona inmunizada. Esto permite una protección inmediata, pero la inmunización pasiva puede durar solo unas pocas semanas o meses. Los anticuerpos se transmiten de madres a bebés a través de la placenta y en la leche materna, para proteger a los bebés durante un breve período después del nacimiento. Los anticuerpos (inmunoglobulinas) también se purifican de la sangre o en el laboratorio, estos se pueden inyectar directamente para proporcionar una protección o tratamiento rápido pero de corta duración para ciertas enfermedades, como la rabia, la difteria y el tétanos.


Calidad del anticuerpo, solución de interacción del anticuerpo y tiempo de incubación

Para realizar la transferencia de Western con éxito, la calidad del anticuerpo primario es un factor crítico. Por lo tanto, la validación del anticuerpo es vital para evitar resultados inexactos. La validación incluye determinar la concentración óptima de anticuerpos para la proteína de interés. La aparición de múltiples bandas no significa necesariamente que el anticuerpo reconozca bandas no específicas, ya que algunas proteínas pueden ser modificadas postraduccionalmente o empalmadas alternativamente dando como resultado formas que corren en diferentes masas moleculares pero contienen el mismo epítopo reconocido por el anticuerpo [20 , 21]. Sin embargo, muchos anticuerpos comerciales muestran una unión no específica a antígenos distintos de la proteína diana. Algunos de los anticuerpos que reconocen proteínas inespecíficas todavía se pueden utilizar para transferencia Western si las interacciones inespecíficas ocurren en una masa molecular que es suficientemente diferente de la proteína diana para permitir una cuantificación precisa de la proteína diana. Las interacciones no específicas a veces se pueden reducir reduciendo la concentración del anticuerpo primario y / o variando el período de tiempo de incubación. Reactivo de bloqueo ineficaz o tiempos de bloqueo insuficientes son errores comunes que dan como resultado bandas no específicas aumentadas; sin embargo, se necesita precaución ya que el bloqueo excesivo también da como resultado una intensidad de señal deficiente de la proteína diana. Hemos encontrado que algunos anticuerpos dan señales más fuertes cuando se incuban a temperatura ambiente durante 2 & # x020134 horas que cuando se incuban durante la noche a 4 & # x000baC. La cantidad de Tween 20 utilizada en los tampones también es importante para reducir la tinción de fondo [22].

La especificidad de los anticuerpos se puede determinar fácilmente utilizando controles positivos y negativos. Los mejores controles positivos son proteínas purificadas o lisados ​​que sobreexpresan la proteína diana, mientras que los mejores controles negativos son tejidos de lisados ​​celulares o tejidos animales knock-out. Algunas empresas venden péptidos al epítopo reconocido por los anticuerpos que pueden usarse para verificar que el anticuerpo se une específicamente al epítopo diana. Como último recurso, si la proteína purificada o los lisados ​​que sobreexpresan la proteína diana no están disponibles, muchas empresas como Aviva Systems Biology, Cell Signaling Technology y Santa Cruz Biotechnology tienen lisados ​​disponibles para muchos tejidos y células, que pueden usarse como controles positivos si se sabe que las proteínas diana se expresan en gran medida en estos tejidos o células. La especificidad de los anticuerpos también se puede determinar de forma exhaustiva utilizando microarrays de proteomas completos [23]. La necesidad de verificar los anticuerpos se ejemplifica en una publicación reciente que mostró un alto riesgo de señal artefactos cuando se realiza una transferencia de Western con anticuerpos anti-tau utilizados habitualmente [24]. Este manuscrito recomienda encarecidamente el uso de controles positivos y negativos en todos los experimentos para la detección de tau [24]. Recomendamos el uso de controles negativos y positivos en al menos un experimento de transferencia de Western para cada anticuerpo.

Usar la capacidad del anticuerpo para detectar el peso molecular correcto como único criterio para juzgar si el anticuerpo es específico para la diana no es satisfactorio, ya que muchas proteínas migran de forma anómala en SDS-PAGE. La propia proteína diana puede migrar a una masa molecular diferente a la esperada, o una proteína que interactúa con el anticuerpo no específica puede migrar a la misma masa molecular esperada que la proteína diana. La misma proteína también puede migrar de manera diferente en relación con otras proteínas en diferentes tipos de geles SDS-PAGE. Los ejemplos incluyen calmodulina y troponina C cardíaca, que migran de manera diferente cuando se unen al calcio en comparación con cuando está presente EGTA, lo que evita que el calcio se una a las proteínas [25, 26]. Otro ejemplo es CSQ1, que tiene una masa molecular predicha de aproximadamente 45,3 kDa pero se ejecuta en un gel Tris-HCl pH 8,3 SDS-PAGE por encima de CSQ2 a aproximadamente 63 kDa [6], pero en un gel Bis-Tris-HCl pH 7,3 migra más rápido que CSQ2 [27]. Un principio importante de SDS-PAGE es que durante la desnaturalización de las proteínas de muestra, el SDS se une a las proteínas en exceso, lo que da como resultado una carga negativa global neta que reemplaza la carga neta intrínseca de las proteínas [28]. Sin embargo, las proteínas que son altamente aniónicas o contienen regiones con altos niveles de residuos de ácido glutámico y / o aspártico a menudo migran a masas moleculares más altas de lo previsto, posiblemente porque la gran cantidad de residuos intrínsecos cargados negativamente previene la unión significativa de SDS a ciertas regiones del proteína. El CSQ1 humano tiene 14% de ácido glutámico y 12,1% de residuos de ácido aspártico (número de acceso Uniprot <"type": "entrez-protein", "attrs": <"text": "P31415", "term_id": "341940551" >> P31415), mientras que la presencia natural media de ácido glutámico y aspártico en las proteínas es del 6,3 y del 5,2%, respectivamente [29]. Dependiendo de la proteína investigada, el uso de enzimas específicas como las proteínas quinasas también podría afectar el patrón de migración de las proteínas. Un ejemplo es la troponina I recombinante incubada con la proteína quinasa A y la posterior determinación de los niveles de fosforilación de la troponina I por anticuerpos de la troponina I desfosforilada y fosforilada: se detectó una banda de menor peso molecular debido a los contaminantes en la proteína quinasa A que degradaban parcialmente la troponina I [30 ].

Después de validar que el anticuerpo reconoce específicamente la proteína diana, es importante determinar el rango dinámico lineal para la proteína diana utilizando el anticuerpo validado contra las muestras que se están investigando. Los diferentes anticuerpos muestran diferentes rangos dinámicos lineales, especialmente a niveles altos de proteína total (Figura 2). Usando Western Blot, se encontró que la expresión de la proteína Bag3 aumentaba 23 veces cuando se co-expresaba con HspB8 en células HEK293 [31]. Cuando la cantidad de muestra de HEK293 se incrementó 10 veces, se determinó que la expresión de Bag3 aumentaba sólo 4 veces [31]. Los cambios de veces en la expresión de proteínas detectados disminuyeron con el aumento de la carga de proteínas. Por tanto, es fundamental que las transferencias de Western se lleven a cabo dentro del intervalo lineal del anticuerpo que se utiliza. Esto se puede llevar a cabo fácilmente mediante Western blots utilizando diferentes diluciones de muestra. Para mejorar la precisión de los datos en la transferencia Western, estas curvas de calibración o dilución deben realizarse para cada anticuerpo.